Southern blot实验方法与步骤详解

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用于检测重组 DNA，也可分析DNA样品中是否有与探针序列同源的DNA片段。用于基因诊断，也可验证检测片段的分子量大小。

将基因组DNA经限制性内切酶酶切，进行琼脂糖电泳，把分离后定位在凝胶上的不同分子量的DNA经碱变性处理，将凝胶中变性的DNA转移至一固相支持滤膜。利用标记的某一DNA、RNA或寡核苷酸与固着于滤膜上的DNA发生同源性杂交，利用放射自显影(化学发光法或显色法)检测。

(一)器材：台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪 ，水平电泳槽，杂交炉，杂交袋，尼龙膜或硝酸纤维素膜，转印迹装置，滤纸，吸水纸，紫外交联仪或80℃烤箱，摇床，X线胶片。

(二)试剂：限制性内切酶 ，DNA加样缓冲液，DNALadderMarker，0.25MHCl，变性液(0.5MNaOH，1.5MNaCl)，中和液(0.5MTris-HClPH7.5，3MNaCl),转印迹液20╳SSC(3MNaCl，0.3M柠檬酸钠，PH7.0)，标记探针，2╳SSC，预杂交液和杂交液，2×洗液(2×SSC,0.1%SDS),0.5×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS),1×缓冲洗液(0.1M马来酸，0.15MNaCl,PH7.5,0.3%Tween20),1×封阻液[1%(W/V)封阻剂溶于1×马来酸溶液(0.1M马来酸，0.15MNaCl,PH7.5)]，1×检测液(0.1MTris-HCl,0.1MNaCl,PH7.5)，抗-地高辛-碱性磷酸酶。

注意：若基因组 DNA过低，要以较大体积进行限制酶消化，消化完毕后，可以通过乙醇沉淀、浓缩DNA片段，加少量DNA加样缓冲液点样。

2、消化好的样品点样于0.7%琼脂 糖凝胶进行电泳;

注意：为保证DNA均匀分散于加样孔，应缓慢将样品加至加样孔。

3、电泳结束后，将凝胶依次用如下试剂处理进行碱变性，室温下轻轻摇动确保溶液覆盖凝胶0.25MHCl10-15min

蒸馏水摇洗5min

变性液40min

蒸馏水摇洗5min

中和液15min，2次;

4、在凝胶碱变性的同时，制备转印迹装置。Southernblot转膜技术有三种：1)，毛细管转移法;2)，电转移法;3)，真空转移法。

这里介绍最经典的毛细管转移法(向上转移)，在转印迹槽中，倒入20╳SSC溶液，槽中置一固相支持物，在固相支持物上从下向上依次置入：两张与凝胶等宽的滤纸，将滤纸纵向自固相支持物垂于转印迹槽中(简称“桥”)，底面在上的凝胶，滤膜(与凝胶等大)，滤纸(与凝胶等大)，吸水纸(略小于滤纸，5-8cm高)，400-800g重物。凝胶四周用Parafilm膜包围防止短路。

滤膜事先用2╳SSC浸湿至少5min。滤纸事先用20╳SSC浸湿。转膜4-18小时;

注意：转膜装置中各层滤纸和膜之间要将气泡赶净。一旦建立转膜系统后，要防止滤膜和凝胶错位。防止吸水纸倒塌和完全湿透，要及时更换吸水纸。

5、转膜结束后，取出滤膜，边角剪一小角做标记。滤膜于2╳SSC摇洗5min，用滤纸吸干;

6、用紫外交联照射(正面朝上)或于80℃烤箱烘烤0.5-2小时;

7、膜可立即进行预杂交和杂交，或保存于4℃待以后应用;

8、预杂交和杂交

1)将杂交膜浸湿于6╳SSC2min，同时预热预杂交液和杂交炉至预杂交温度;

2)杂交膜封于杂交袋，按0.2ml/cm2膜面积加入预杂交液，预杂交至少1小时;

3)用于southernblot的探针可分为DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针。对探针的标记方法又可以分为放射性标记和非放射性标记。

这里主要介绍非放射性地高辛标记探针的杂交方法。杂交时各种探针的用量：DNA探针，5-25ng/ml;RNA探针，100ng/ml;寡核苷酸探针，0.1-10pmol/ml。双链DNA探针提前100℃变性10min后迅速冰浴，单链探针无需变性。将处理后的探针加入杂交液温浴至杂交温度。杂交温度的选择根据杂交液的不同而不同;

注意：应用寡核苷酸探针时，杂交温度的选择。Tm=4╳(GC)2╳(AT),杂交温度比Tm低约10℃。

4)弃去预杂交液，将含探针的杂交液注入杂交袋，至少3.5ml/10╳1℃m，置入杂交炉滚动;

9、杂交后的洗膜处理过程，顺序如下：

2×洗液2×15min

0.5×洗液2×15min

1×缓冲洗液1×3min

1×封阻液1×60min

抗体液1×30min

1×缓冲洗液2×15min

1×检测液1×5min

~undefined抗-地高辛-碱性磷酸酶用1×封阻液稀释10，000倍(若用显色法稀释5000倍;若用CDP-Star检测用20，000倍稀释);

10、将膜浸于CSPD液(CSPD用1×检测液稀释100倍，CDP-Star也用1×检测液稀释100倍)室温避光静置5min;回收剩余的CSPD液或CDP-Star液避光保存于4℃可反复应用3-5次;

11、将膜上残液吸净，用保鲜膜封好于37℃反应15min，然后将膜固定于压片夹，进行曝光。

注意：若用显色剂检测，新鲜配置显色剂(45μlNBT和35μlBCIP溶于10ml1×检测液)，将膜浸于显色剂中避光反应4-16小时，反应期间不要移动膜。