丁香实验_LOGO
登录
提问
提问
我要登录
|免费注册
丁香通
点赞
收藏
wx-share
分享

凝胶蛋白检测技术

互联网

1849

凝胶蛋白检测技术
理想的检测方法必须具有以下特点:

①良好的线性范围,即染色强度与蛋白质量成正比;

②良好的通用性,即对不同蛋白质具有相同的染色能力;

③良好的兼容性,检测后不影响后续的鉴定过程,即不影响蛋白质或多肽在质谱仪中的离子化过程;

④高灵敏度,检测出尽量多的低拷贝蛋白;

⑤高稳定性和重复性。但目前仍无完全符合上述条件的检测方法。

考马斯亮蓝染色、银染等各种传统显色技术对于蛋白质组学高灵敏度、高重复性、宽线性和高度自动化的要求逐渐显出局限性,目前不断有新的检测技术开发出来,如荧光标记、同位素标记等,但目前最常用的还是考马斯亮蓝染色和银染。
混合蛋白质经二维凝胶电泳分离后采用灵敏、合适的检测方法是呈现分离效果的关键步骤。

考马斯亮蓝染色的检测灵敏度约为0.1ug;银染则可检测到long的蛋白质;荧光染色的灵敏度是银染的两倍。经过考马斯亮蓝、荧光染色过的凝胶可以进行质谱分析,经普通银氨染色的凝胶则无法做质谱分析,快速银染法虽然检测灵敏度低于普通银氨染色法,且染色背景较深,但经过快速银染法染色的凝胶可以进行质谱分析。
(1)考马斯亮蓝染色的主要步骤:

①将凝胶移人一个盛有适量的染色液(脱色液I加入0.25%考马斯亮蓝R―250)的容器内,脱色摇床染色2h或过夜。

②弃去染色液,将凝胶在脱色液I(乙醇:冰乙酸:水=25:8:65)中继续在摇床上震荡脱色。为脱色完全,需数次更换脱色液I。

③当凝胶上的斑点清晰、凝胶背景较浅时,倒去脱色液I,加入脱色液Ⅱ,凝胶置于脱色液Ⅱ(乙醇:冰乙酸:水=10:15:175)中保存。
(2)快速银染的主要步骤:45%乙醇+5%乙酸固定60min,水洗每次45min,共2次。用0.02%Na2 S2 03 敏化l~2min,水洗每次1min,共3次。浸入0.1%AgNOa中,4℃放置30min,水洗每次1min,共3次。加入显影液(2%Na2 C03 含0.04%甲醛),显影至蛋白质点清晰可见,倒出显影液,将凝胶保存在5%乙酸中。

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序