PCR技术基本原理

PCR 技术的基本原理 　类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR 由变性 -- 退火 -- 延伸三个基本反应步骤构成：

① 模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至<chmetcnv>93 ℃</chmetcnv>左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

② 模板 DNA 与引物的退火 ( 复性 ) ：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至<chmetcnv>55 ℃</chmetcnv>左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；

③ 引物的延伸： DNA 模板 -- 引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性 -- 退火 -- 延伸三过程，就可获得更多的 “ 半保留复制链 ” ，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需 2 ～ 4 分钟， 2 ～ 3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期 (Plateau) 所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

PCR 的反应动力学 　 PCR 的三个反应步骤反复进行，使 DNA 扩增量呈指数上升。反应最终的 DNA 扩增量可用 Y ＝ (1 ＋ X)n 计算。 Y 代表 DNA 片段扩增后的拷贝数， X 表示平 (Y) 均每次的扩增效率， n 代表循环次数。

平均扩增效率的理论值为 100% ，但在实际反应中平均效率达不到理论值。

反应初期，靶序列 DNA 片段的增加呈指数形式，随着 PCR 产物的逐渐积累，被扩增的 DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现 “ 停滞效应 ” ，这种效应称平台期数、 PCR 扩增效率及 DNA 聚合酶 PCR 的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

PCR 反应体系的基本成分 模板 DNA 、特异性引物、 DNA 聚合酶、 dNTP 、 Mg2+ 的缓冲液。