甲基化 MSP 特异性 PCR 全程的常见问题与相关控制措施

一、亚硫酸氢钠修饰过程中可能出现的问题及应对措施

亚硫酸氢钠修饰DNA的目的是将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化为尿嘧啶，而甲基化的5一甲基胞嘧啶保持不变。影响此过程的主要因素有修饰试剂的浓度、反应温度、反应环境的pH值及反应时间。其中任何一个环节出现问题都将导致MSP扩增失败，体会如下：

(1)亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3.0～3.9 mol/L为好，其pH值必须用NaOH精确调整至5.0；

(2)修饰时间应掌握在10～16h，修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化成尿嘧啶且DNA模板破坏加剧，而时间过短会导致修饰不彻底

(3)反应温度应控制在50～55℃(若用国产恒温水浴箱建议温度设定在53℃为好)；

(4)DNA模板量应控制在<2ug为宜。

只要遵循以上几点基本上能保证99％未甲基化的胞嘧啶转化尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。但是，此修饰过程中模板DNA有约96％已经降解 。当DNA样品较少时(如石蜡包埋组织、血清DNA)，在纯化回收时可加人适量鲑鱼精DNA或糖原(约1g)作为载体，有利于DNA沉淀(加入载体后轻轻晃动Ependof管可见絮状DNA富集现象) 。

二、甲基化特异PCR可能出现的问题与对策

1．引物因素分析MSP的引物设计的质量是扩增成败的关键性因素。

MSP的引物设计与普通的PCR引物设计不同，MSP的引物设计原理是：模板DNA在经过亚硫酸盐处理后，发生甲基化的基因启动子区域CpG岛内CpG位点5 一端胞嘧啶保持不变；而未发生甲基化的CpG岛内CpG位点5 一端胞嘧啶转化为尿嘧啶，即C-U。针对修饰前后的序列差异用MethPrimer软件设计甲基化与未甲基引物，进行PCR扩增。

MSP的引物序列中至少含有1个以上CpG位点，最好是含有多个CpG位点，这样可保证引物的特异性，同时可以提高DNA启动子甲基化碱基的检出率。MSP的引物必须按亚硫酸氢钠处理后的DNA序列设计。

同时也应该尽可能与普通PCR的引物设计原则相符合。按MSP的要求，任意DNA序列在做MSP扩增时，至少要合成2对引物，即甲基化引物与未甲基化引物。在MSP的未甲基化引物序列中前导引物不含鸟嘌呤碱基，反向引物不含胞嘧啶碱基。初涉及MSP者最好用文献引物进行研究。

如果是为了筛选新的甲基化的抑癌基因而文献中无法找到的相应MSP引物，可用在线MethPrimer软件在线设计引物，根据软件提示可以找到所需要的MSP引物。

但MSP所遇到的困难是，要扩增的是启动子或部分第一外显子序列，其CG含量相对较高，MSP扩增难度加大，因此设计好的引物最好用引物软件如Primer5.0从理论上推测其扩增效率，对于扩增效率<30％ 的引物要进行优化。

方法是：在核心启动子区域前后反复调整甲基化前导引物扩增起始点，以期使引物扩增效率增高，降低扩增难度，从而提高PCR产量。

2．MSP的反应体系问题MSP的反应体系的成分与普通PCR一样，反应体系的优化也与普通类似，反应体系的优化与普通PCR的反应体系中最大的区别是DNA模板不同。

经过修饰后的模板为单链状态，MSP的DNA模板在抽提后应检测其纯度和含量，其纯度要求A260/A280在1.8～2.0之间；其含量要准确检测，否则在亚硫酸盐处理时因DNA模板加的太多而导致DNA处理不完全而导致MSP扩增失败；而加的DNA模板太少则一方面浪费试剂，另一方面会因为目的片段太少导致MSP假阴性。

Mg2+浓度一般在2.0～2.5 mmoL/L为宜，过低过高都不利于扩增。此外，PCR的缓冲液及Taq酶的来源也很重要，一般的PCR缓冲液常常会导致结果不稳定，不同来源的Taq酶也会影响结果的重复性。我们建议用ROCHE公司针对富含CG等复杂二级结构模板的GC RICH KIT效果较好。

而一旦选用某一厂家Taq酶后，不要轻易更换，以免MSP因重新优化而引起的时间和成本的浪费。

3．MSP的反应温度分析MSP扩增的结果有3种情况。

(1)产物电泳为阴性；

(2)产物电泳出现多条非特异性条带(含目的基因条带)；

(3)产物电泳为阳性(仅目的基因条带)。出现前2种情况时，可在保证反应体系和引物没有问题的情况下，通过调整MSP的反应温度而得到目的基因带。

方法如下：PCR反应中，Tm的高低与CG含量呈正相关。因甲基化与未甲基化引物序列差异，在扩增过程中可能会出现PCR偏性。我们建议，提高预变性温度(一般应>95℃，10 rain)和变性温度(>95℃ ，1 min)，退火温度以60℃作梯度或70℃作降落PCR。

总之，在MSP全过程中，影响结果的因素较普通PCR要多得多，只要对实验过程每一步认真控制可完全提高MSP的准确度和精密度。

对于该文章的一些观点，嘉美生物也提出一些意见和大家讨论

1)亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3.0～3.9 mol/L为好。（嘉美生物实验室就答亚硫酸盐就大于这个浓度）

2)修饰时间应掌握在10～16h，修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化成尿嘧啶且DNA模板破坏加剧，而时间过短会导致修饰不彻底。（这点嘉美生物实验室深有体会，因为如上所述，我当时也怀疑4h可能修饰不完全，分别就做了6h，12h，16h。确实发现修饰时间过长，模板破坏加剧，可能不倒2个星期就降解了，当时P处M的，后来居然只能P出U。

3)DNA模板量应控制在<2 g为宜。(这个大家应该都理解，主要是为了修饰完全）

三、BSP（Bisulfite Sequencing PCR）法 (PCR产物直接测序)

服务内容：1. 基因组DNA的Bisulfite转化。2. DNA甲基化检测——基于BSP（Bisulfite Sequencing PCR）法(PCR产物直接测序)。

样品要求：1. 基因组DNA（≥1µg）。2. 若提供的材料为新鲜组织、血液、细胞等生物材料，请提供足够提取1µg以上基因组DNA的材料量。3. 基于所选择的DNA甲基化检测方法，请提供相应的引物或引物序列。

终产品：Bisulfite处理的基因组DNA；实验报告（包括BSP产物的直接测序报告）。

服务说明：在基于Bisulfite转化的DNA甲基化检测方法中，引物是决定实验成败的关键性因素，且视期望检测的目的基因片段的不同，适宜引物的存在与否有较大的不确定性，请尽量采用其可行性经过验证的引物，如因引物等非本公司原因导致某实验步骤失败，使服务提前终止，已启动的实验项目仍正常收费。

若需DNA甲基化检测用引物设计服务，价格另议。视BSP产物序列的不同，采用直接测序有可能导致实验结果的可靠性降低；视BSP引物特异性的不同，BSP产物的克隆测序存在插入片段与目的片段不符的可能性，建议选择同时对多个克隆（>15个）进行测序，以获得足够的数据用于后期分析。
服务价格：