Nature Methods：无需扩增的数字基因表达谱

癌症和干细胞生物学的飞速发展凸显出稀有细胞的重要性。尽管新一代测序技术在基因表达研究上无比强大，但它们对如此少量的细胞还是无能为力。到目前为止，很多方法都需要多步样品制备和扩增，这样就有可能引入人为误差，让表达谱不甚准确。于是，我们需要更高保真性的方法。 

为了绘制极少量细胞的数字基因表达谱，美国Helicos生物科学公司的Fatih  Ozsolak和哈佛医学院的David  T  Ting等扩展了单分子测序（SMS）技术，开发出少量数字基因表达谱（low-quantity  digital  gene  expression,  LQ-DGE）的应用。此成果发表在最新一期的《Nature  Methods》上。 

利用LQ-DGE，Ozsolak等在无扩增步骤的情况下绘制出低至250个细胞的mRNA图谱。他们修改了Helicos的数字基因表达谱方法，在poly(dT)引物包被的流动槽中捕获poly(A)+的mRNA，并直接在测序仪表面开展cDNA的合成，减少了样品操作，因此提高了灵敏度。 

为了确定LQ-DGE与标准DGE方法的关系，研究人员比较了4×106个细胞的DGE图谱和1×103个细胞的LQ-DGE表达谱。结果表明两个数据组存在正相关。之后，他们又用LQ-DGE对微量的降解RNA进行图谱分析，发现新鲜样品与FFPE  RNA样品的LQ-DGE图像之间存在很强的相关性。 

为了证明他们的方法适合相关细胞群体的比较，并能回答生物学相关的问题，作者们分析了两个相关但截然不同的细胞类型：SM25和490。SM25来自胰腺上皮内肿瘤病变，KrasG12D  突变在胰腺特异表达。而细胞系490是来自恶性胰腺导管腺癌病变。他们鉴定出2000多个差异表达的转录本，并通过qRT-PCR验证了其中一部分，证实了LQ-DGE在鉴定相关细胞的微小差异上的能力。

作者认为，与其他低样品量的RNA图谱分析技术不同，LQ-DGE不需要分离RNA或选出mRNA，而是利用高亲和力的RNA-DNA杂交动力学，在流动槽表面直接捕获poly(A)+模板。它也不含片断化或大小选择的步骤，从而将偏向性降至最低，特别是对短的转录本。 

然而，尽管LQ-DGE是传统数字表达谱的重大改进，但它还不能提供完整的转录组覆盖，因为它只检测约8500个转录本。此外，它是对双链DNA测序，这也有一些问题，比如反转录效率低等。这些问题也在一定程度上限制了LQ-DGE的应用。