高分辨率熔点分析技术进行冻存组织样本甲基化的检测

1 、前言

启动子高度甲基化是恶性肿瘤基因转录中的一种很常见的现象，被视为细胞恶性转化的标志之一。DNA 甲基化分析是一种基因检测工具，用于早期癌症检测、风险评估与治疗疗效评估，具有非常诱人的前景。

DNA甲基化检测最常用的方法主要依赖于亚硫酸氢钠对基因组 DNA 的处理，将胞嘧啶转换成尿嘧啶，未修饰 5-甲基胞嘧啶。经过修饰的基因序列发生改变，可对后续的 PCR 扩增产物中的甲基化胞嘧啶进行鉴别。

通过亚硫酸测序分析，可对基因甲基化情况进行最准确的评估，可鉴定单甲基化胞嘧啶。并开发出了几种更加简单的以 PCR为基础的方法，这些方法对于小规模的研究性实验室来说，非常重要。这些方法较新、较简单、容易操作。高分辨率熔点分析方法（HRM）即是这几种方法之一。HRM 是基于溶液中 DNA 的“熔解”特性。该方法的原理是，通过基于不同熔解温度的熔点分析，区分出具有不同甲基化胞嘧啶含量的双硫酸处理的 DNA 模板。由于不需要昂贵的探针与内参基因进行标准化处理，HRM 是一种相对简单，而成本又较低的方法。通过 HRM 技术的应用，可对扩增子内所有 CpGs 进行分析，根据熔解曲线的形状，可对同源性及异源性甲基化进行区分。这一点非常重要，因为启动子 CpG 岛的甲基化模式通常为非同源性。

对于生物标志物检测来说，冻存组织是一种非常重要的资源。于福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织上，对主要分析方法的性能进行了检测。当前研究的目的，是对结直肠癌个体冻存 FFPE 组织上启动子甲基化检测 HRM 分析进行评价及确证。

2、 材料与方法

对照与研究样本

将CpGenome通用甲基化 DNA（Chemicon/Millipore,Billerica, MA）与来自外周血单个核细胞（PBMNCs）DNA 作为甲基化与非甲基化对照。于非甲基化 PBMC DNA 中对甲基化对照 DNA 进行稀释处理，生成甲基化标准品（50%、25%、10%、5%、1% 与 0.1%）。HRM 检测优化后，我们对来自于结直肠肿瘤个体的冻存组织样本进行了分析。

DNA提取与双硫酸修饰

对来自于培养肿瘤细胞系的健康志愿者 PBMNC DNA 与 DNA 进行分离。对于来自于冻存研究组织的 DNA 分离物来说，使用的是来自于 FFPE 肿瘤组织块的 10 μm 厚度的切片。  

MethyLight 检测

有关MGMT 与 APC MethyLight 检测说明，见前期文献描述。简言之，于 LightCycler ®  480 仪器上进行 PCR。

高分辨率熔点分析

于 LightCycler ®  480 仪器（罗氏）上进行 PCR 扩增与 HRM。考虑到 FFPE DNA 呈高度片段化，大的扩增子会导致熔点分辨率降低，扩增子被设计为不超出 200bp。

使用 Gene Scanning 与 TM Calling 软件模块（罗氏）进行 HRM 数据分析。通过对代表着 PCR 产物熔解前及熔解后两个标准化区域的计算，对熔解曲线进行标准化处理。通过这种计算，可对具有不同起始荧光强度的样本进行直接比较。标准化温度转换熔解曲线图显示，随着温度升高， 荧光强度降低。

3 、结果与讨论

对标准稀释品进行检测，测定 HRM 检测的灵敏性。通过所有 HRM 检测（APC、MGMT、GSPT1，与 PTEN），我们可以在保证重现性的基础上，于非甲基化 DNA 背景中，检测到 1% 的甲基化的 DNA（图 1A-D）。

图 1：MGMT（A）、APC（B）、GSTP1（C）与 PTEN（D）甲基化 HRM检测灵敏性。以三种方式显示甲基化标准曲线。100 % 甲基化显示为红色、50 % 甲基化显示为橙色、25 % 甲基化显示为绿色、10 % 甲基化显示为蓝绿色、1% 甲基化显示为黄色、0.1% 甲基化显示为紫色，0 % 甲基化显示为蓝色。

下一步，我们对福尔马林固定、是蜡包埋处理对启动子高度甲基化检测的作用进行了评价。我们能够对 APC启动子高度甲基化进行检测，检测可靠性较高。图 2（A–C）显示，新鲜与 FFPE 细胞系 DNA APC HRM 检测重现性与一致性较近似。

图 2：使用来自于不同肿瘤细胞系--甲基化标准品（黑色曲线、100 %、50 %、25 %、10 %、1%、0.1%、0 %）与样本（彩色曲线）均呈三重显示。甲基化标准品（黑色曲线、100 %、50 %、25 %、10 %、1%、0.1%、0 %）与样本（彩色曲线）均呈三重显示。（C）来自于 8 份乳腺癌与前列腺癌细胞系的新鲜与 FFPE 肿瘤细胞系 DNA APC HRM 检测的批间变异性。条形图代表 6 个独立性实验的平均值及标准差。

FFPE 组织启动子 HRM 甲基化分析具有以下潜在应用前景。对具有淋巴结及远处转移的原发肿瘤甲基化的确定，不仅可阐明疾病进展过程中发生的表观遗传学事件，而且可辅助确定石蜡包埋组织样本的预测性标志物。

4、 结论

我们的研究进一步证实了 FFPE 组织启动子甲基化分析定量 HRM 的适用性。FFPE 组织是正常对照与病变组织最大的样本材料来源，这些组织的应用，对于研究来说具有不可估量的价值。方法学评价对于实验稳定性的确证非常重要，可辅助确立该检测方法是否适合作为一种研究工具以及可能的常规检测手段。

“三好一快”的罗氏LightCycler ®  480实时定量PCR系统

全新体验谋求突破，创新设计诠释经典！

LightCycler ® 480是罗氏公司经过十多年不断的创新和积累，精心打造的经典款全自动可变通量的实时荧光PCR系统，系统包含温控模块、氙灯光源、光学检测系统、配套试剂耗材、以及专用的数据采集及分析软件。其集灵活、快速、精准于一体，为基因表达和遗传分析提供了高效的科研和诊断平台。

♦ 温控好：仪器的温控系统引入了具有独家专利的Therma-baseTM技术，在加热和冷却元件之间引入的高效液体导热层，其无与伦比的孔间温度均一性可达±0.1℃，是目前板式实时定量PCR中最高水平，保证了良好的重复性和数据的均一性，可达到单拷贝检出的灵敏度，覆盖多达11个数量级的动力学范围，并能准确区分出低至1000和2000拷贝的浓度差异，同时可实现HRM高分辨率熔解曲线分析技术的高级应用。

♦ 光源好：使用宽光谱、高强度的氙灯作为光源，实现最佳的荧光激发效率。配合独有的五棱反射光学系统，有效加长光程，可以显著消除同类仪器普遍存在的边缘效应。并选用冷CCD以保证了最高的检测灵敏度。

♦ 检测好：通过激发波长和发射波长的任意组合，与实时荧光PCR实验中常见的荧光染料完全兼容，让您自由选择任意分析模式。配套软件操作简便，界面友好，让用户能够轻松、省时地处理高通量的实验数据。数据分析模式可灵活切换，支持绝对定量、熔解曲线、相对定量、自动基因分型和高分辨率熔解曲线分析等功能。罗氏独特的PCR扩增效率校正（E-Method）算法保证实验精确度，符合国际公认的MIQE标准。

♦ 反应快：384孔板完成40个循环的时间少于50分钟，96孔板完成40个循环的时间少于30分钟。

罗氏公司同时提供多种系列检测试剂盒--LightCycler ®  480 SYBRⅠMaster, LightCycler ®  480 Probe Master, LightCycler ® 480 Genotyping Master, LightCycler ® 480 HRM Master等，广泛适用于核酸定量、基因表达、基因分型、甲基化分析、突变位点筛查、芯片检测验证以及SNP位点发现等多种领域，并获得国家食药监局SFDA医疗器械注册证。迄今为止，已经发表超过25,000篇相关文献报道。

罗氏强大的市场销售团队、技术支持和工程师团队遍布于全中国，坐落于上海总部的亚太区技术支持中心，通过免费的技术服务热线，第一时间响应您在使用过程中需要解答的任何问题，提供优越的售前产品咨询、售后技术支持的全程服务，以最佳的解决方案加速您的研究进程。直观专业的培训教程，手把手引导您快速进入角色，成为实时荧光定量PCR软硬件操作的专家。

罗氏LightCycler ®  480实时荧光PCR系统：操作便捷，结果准确，重复性高，是您进行实时荧光PCR实验的明智之选。