如何从粪便中快速提取基因组DNA

        粪便基因组DNA快速提取方法，无抑制物，可直接做PCR。采用硅胶膜技术从新鲜或冷冻人类粪便或其他样品类型（混有高浓度的PCR抑制剂）中抽提多至30μg 的基因组、细菌、病毒和寄生物DNA。独特的吸附树脂配合经优化的缓冲液可去除PCR抑制剂。方便的Aidlab 离心柱纯化过程只需40分钟，用于从粪便中纯化最多30μg 基因组、细菌、病毒和寄生虫DNA；快速纯化高品质，即用型DNA；无有机提取或乙醇沉淀；持续的高产量；彻底去除污染物和下游反应抑制物。纯化的DNA长度可达50 kb。该长度的DNA变性完全，并具有最高的扩增效率。高纯度的DNA可直接用于下游扩增反应。原理，方法，操作一致。完美替代Qiagen公司QiaAmp DNA Stool Mini Kit。

产品介绍：

        常规的DNA纯化方式并不能有效地去除粪便中存在的大量抑制因子而导致下游实验的失败，如PCR不能扩增出所需片段。该试剂盒采用DNA吸附柱和新型独特的溶液系统，能有效去除动物粪便中各种影响下游实验（如PCR）的抑制因子，并能高效地回收粪便中的基因组DNA。动物粪便样品经特殊缓冲液ASL重悬后，70℃处理5分钟裂解细菌；离心去除不溶解的杂质，蛋白酶K消化进一步去除蛋白和杂质；然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

产品特点：

1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。

2.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

3.快速，简捷，单个样品操作一般可在40分钟内完成。

4.多次柱漂洗确保高纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值达1.7～1.9，可直接用于PCR，Southern-blot和各种酶切反应。

注意事项：

1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

2.开始实验前将需要的水浴先预热到70℃备用。

3.结合液CB和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

4.洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在－20℃。DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mMTris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

5.PCR可能被过量的DNA（一般大于1μg）抑制，使用最小用量的洗脱DNA（适当稀释）反而可以得到更好的扩增。一般加入的洗脱DNA体积不要超过总PCR反应体积的10％。
我们建议在PCR反应体系中加入终浓度0.1 μg/μl的BSA（牛血清白蛋白）有助于得到最佳扩增效果。

操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）

提示：第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

1.收集约200-220mg粪便到一个2ml离心管，置冰上。
如果是冰冻的标本，加入缓冲液ASL前不能解冻，否则DNA容易降解。

2.加1.4ml 缓冲液ASL，连续涡旋振荡1分钟或者直到完全混匀均一。
注意完全涡旋混匀，否则会严重降低产量。

3.将重悬物70℃温育5分钟。
该加热步骤可以提高3-5倍DNA产量，并且帮助裂解细菌和寄生虫。对于某些难裂解的细胞（如革兰氏阳性菌）可以提高到95℃。

4.涡旋振荡15秒，室温放置1分钟。最高速离心1分钟沉淀粪便颗粒。

5.转移900μl上清到一个1.5ml离心管，加入100μl杂质清除剂AB，立刻涡旋振荡1分钟或者直到完全混匀均一，室温放置1分钟。最高速离心3分钟去除杂质。

6.转移所有上清到一个1.5ml离心管，最高速离心3分钟。

7.转移210μl上清到一个1.5ml离心管，加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混匀，加入200μl结合液CB，涡旋振荡15秒，充分混匀。70℃温育10分钟。
如果产量偏低，可以转移更多的上清，并且相应的按比例提高蛋白酶K和结合液的和后面的异丙醇使用量。

8.冷却后加入100μl异丙醇，涡旋混匀。

9.将上一步所得溶液和可能出现的沉淀都加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。

10.加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 离心30秒，弃废液。

11.加入700μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

12.加入500μl漂洗液WB，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

13.将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

14.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100－150μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液可事先在65-70℃水浴中预热），室温放置2分钟，12,000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。

15.DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在－20℃。

 
图片说明：用Aidlab粪便基因组DNA提取粪便基因组DNA，然后用某肠道病原体引物进行PCR扩增。泳道M：100 bp DNA Ladder；泳道1-3：对肠道病原体检测的PCR结果。