比较间接免疫荧光法和酶联免疫吸附法检测

比较间接免疫荧光法和酶联免疫吸附法检测血清中抗ds-DNA抗体在系统红斑狼疮中的诊断价值

俞颖    范永升   温成平   王新苍

抗双链DNA (double-st randed DNA ，ds-DNA) 抗体主要见于系统性红斑狼疮( systemic lup userythe-matosus ，SLE) ，对诊断SLE有较高的特异性，被称为SLE的“标记性抗体”，其对SLE的高度特异性而被列为SLE诊断标准之一[1]。相关研究表明[2]：在未治疗的SLE患者中，抗dsDNA抗体的诊断特异性为95%，敏感性为70%，且抗dsDNA抗体的产生常提示有肾脏损害，因此，抗dsDNA抗体常被作为SLE的活动指标，用于监测SLE病情变化，疾病活动期判断及药物治疗效果观察等。

目前市场上已有多种检测抗ds-DNA抗体的商品试剂盒，如短膜虫间接免疫荧光法(CL-IIF) 、免疫印迹法、胶体金斑点法、Farr 放射免疫测定法和酶联免疫吸附法等，鉴于免疫印迹法，胶体金斑点法仅用作阴阳性判断，而无法监测双链DNA抗体的浓度变化，而放射免疫测定法由于其潜在危害性临床较少使用，本研究选择各临床实验室较常用的短膜虫间接免疫荧光法和酶联免疫吸附法对抗ds-DNA 抗体进行研究，通过比较其在SLE 及其活动期、其他结缔组织病和健康人群中的敏感性和特异性，实验室操作方便性，室间检测结果可比性等，以探究出最适合SLE筛查与临床监测的检测方法学。

1、对象与方法

1.1、对象：选取在浙江中医药大学附属第一医院及第二医院就诊患者270例，其中，SLE患者110例，全部符合1997 年美国风湿病学会(ACR) 分类标准[3]，其中女性98 例，男性12例，年龄16～65 岁，平均(34 ±12) 岁；病程2 周～28年，平均4年。110 例SLE患者中，疾病稳定期40例，疾病活动期70例，疾病活动度判断根据2000 年修订SLE疾病活动指数( SLE DAI 22000) ： < 10 分示疾病稳定，≥10 分示疾病活动[4]；疾病对照115例（干燥综合征31例、混合性结缔组织病23例、类风湿关节炎43例、系统性硬化症18例，均符合国际诊断标准）及45例健康对照。

1.2、检测方法：(1) 短膜虫间接免疫荧光法：试剂盒购自北京欧蒙公司，血清按1：10稀释，如抗ds-DNA 抗体阳性，继续血清倍比稀释，测定其最终稀释度，严格按说明书操作（2）酶联免疫吸附法：试剂盒购自上海富莼科芯生物技术股份有限公司，血清按1：50稀释，全程75分钟反应结束后读取标本吸光度值，用直线回归计算出待测样本浓度值，100 IU/ml及以上判定为阳性，严格按说明书操作。

1.3、统计学分析：比较采用χ2 检验，用描述性统计方法及统计分析。P < 0. 05 为差异有统计学意义。

2、研究结果

2.1、两种方法检测SLE组及疾病对照组、健康对照组中抗ds-DNA 抗体的敏感性和特异性(见表1) 。110 例SLE患者采用CL-IIF 法检测抗ds-DNA 抗体有32例阳性，敏感性为29.1%，特异性为94.4%，而在疾病对照组仅有SS (干燥综合征) 中2例、MCTD(混合性结缔组织病) 中3例、RA (类风湿关节炎) 中4例，敏感性分别为6.5%、13.0%、9.3%；采用酶联免疫吸附法检测抗ds-DNA 抗体有86例阳性，敏感性为76.4%，特异性为97.5%，而在疾病对照组仅有SS 中1例、MCTD 中2例、RA 中1例，敏感性分别为3.2%、8.7%、2.3% ，两种检测方法中，SLE患者均明显高于疾病对照组及健康对照组，差异有统计学意义( P＜0.01) 。

 

2.2、两种检测方法在SLE疾病稳定组和疾病活动组检测结果(见表2) 。采用CL-IIF法40例疾病稳定组中有7例阳性，阳性率为17.5%，而70例疾病活动组中有25例阳性，阳性率为35.7 %。两者比较差异有统计学意义( P < 0. 05)；用酶联免疫吸附法40例疾病稳定组中有16例阳性，阳性率为40%，而70例疾病活动组中有68例阳性，阳性率为97.1%，两者比较差异有统计学意义( P < 0. 01)，且两种方法学比较差异具有统计学意义（P < 0. 01）。

2.3、对两种检测方法检测SLE患者所得阳性结果进行分析（见表3）。本研究选取20例两种检测方法均为阳性的患者检测值，结果显示：间接免疫荧光法检测结果由于用半定量的滴度表示，样本检测值常出现堆积情况，稀释比例相同的样本其对应酶联免疫吸附法检测值各不相同，且具有明显差异；从本研究20例的样本检测值来看，两种方法之间没有明显的相关性，这可能与两种检测试剂盒抗原来源不同有关，从表3可以看出，酶联免疫吸附法能提供具体浓度值，给临床医生反馈更直观，适合对患者进行浓度监测，而间接免疫荧光法由于只能用粗略的滴度来表示，不利于区分待测样本的浓度差异。

3、讨论

 系统性红斑狼疮是一种病因不明的全身性慢性自身免疫性结缔组织病，很多红斑狼疮患者在早期并没有得到及时的诊断和合理的治疗 多数患者最后确诊红斑狼疮时已发生肾脏等重要器官严重损害[5]，因此需要敏感性高、特异性强的诊断方法，以采取早期干预和治疗手段，并需较准确反映其抗体浓度变化以动态监测疾病发展，对延缓和治愈疾病都有非常重要的价值[6]。

 然而，一直以来，间接免疫荧光法被认为是检测抗ds-DNA抗体的金标准，但是其敏感性与特异性较酶联免疫吸附法均偏低[7]，本研究中，短膜虫间接免疫荧光法检测抗ds-DNA抗体的敏感性为29.1%，特异性为94.4%，而酶联免疫吸附法检测抗ds-DNA抗体的敏感性为76.4%，特异性为97.5%，综合性能上明显优于间接免疫荧光法，更适合用作SLE疾病的初筛方法，以防止漏检误检。

 抗ds-DNA抗体除帮助诊断SLE外，尚可判断SLE的活动性及作为治疗的评估，已证明抗ds-DNA抗体与DNA结合成为免疫复合物，在肾小球基底膜或多种器官微血管沉积，或抗ds-DNA抗体直接作用于肾小球抗原或其他抗原，激活补体，而造成SLE患者的损害[8]。在针对SLE疾病活动性检测时，两种方法在SLE患者疾病活动期，对抗ds-DNA抗体检出率明显增高，差异有统计学意义( P < 0. 01) ，说明抗ds-DNA抗体与SLE疾病活动度密切相关，其抗体效价随疾病的活动或缓解而升降，对SLE活动度的识别、判定具有很高价值。鉴于此，在选择合适的检测方法用于抗ds-DNA抗体浓度检测时，酶联免疫方法学检测结果应能直观反映浓度值，通过浓度的细微变化来反映SLE患者的病情变化，而间接免疫荧光法报告结果粗糙，只有稀释比例，检测结果常出现堆积，不易区分不同病情的浓度值和血清抗体浓度的变化。

 因此，建议用酶联免疫方法学对抗ds-DNA抗体进行初筛与监测，以防止漏检，并动态监测其抗体变化水平，对疾病预后作参考。

参考文献

[1]韩锋 ，齐文成 ，唐志琴 ，王玉亮 . 系统性红斑狼疮与外周血T细胞亚型的相关性研究，中国药物与临床 2004,4(5):385-387

[2]陈君敏，郑玲，叶德富，翁义锐. ELISA 检测自身抗体诊断系统性红斑狼疮临界值的初步探讨，福建医科大学学报　2004,38(4):460-462

[3]Hochberg MC. Updating the American College of Rheumatology revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus . Art hritis Rheum , 1997 , 40 (1) :1725.

[4]Gladman DD , Ibanez D , Urowitz MB. Systemic lupus erythematosus disease activity index 2000 [J ] . J Rheumatol , 2002 , 29 (2) :288-291.

[5]李胜光 ，黄烽. 系统性红斑狼疮的生物标记，中华风湿病学杂志 2005.9(4):250-253

[6]黄毅，伍延安，马晓宁 等. 抗核抗体、抗双链DNA 抗体与红斑狼疮活动期的相关性 福建医科大学学报, 2004 ,38 (1) :425-426.

[7]兰小鹏, 黄俏佳, 涂向东, 等. 快速斑点免疫金渗滤法检测抗双链DNA 抗体. 中华皮肤科杂志, 1997 ,30 (1) : 49-50.

[8]Wallace DJ , Hahn BH. Lupus Erythematosus. 5thed. Baltimore :Williams ,1997 :383～546