慢病毒使用操作指南

一、慢病毒的储存与稀释：

1. 病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）

注：A．病毒可以存放于-80℃ 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度。

B．反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。

2. 病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完)，分装后使用。

二、慢病毒用于体外（in vitro）实验：感染培养原代细胞和建系细胞

1. 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用Invabio提供的慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体内（in vivo）注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）

2. 慢病毒感染目的细胞预实验

① 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项

A． 测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的（HEK293T，Hela） 细胞作为平行实验的对照细胞。

B．在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清、双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。

C．Invabio提供的病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如：病毒滴度为>1X10⁸ TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X10⁸个具有生物活性的慢病毒颗粒。

② 以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验

实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液

第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3~5X10⁴个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养基体积为100 μl；进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。

第二天，观察细胞生长状态，如细胞状态较好则开始实验：

1、取出4℃保存的病毒，使用台式离心机离心20 秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验室的实际情况将按照MOI 准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率。

2、病毒准备好之后，从培养箱中拿出细胞，

a 使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基

b 吸去原细胞培养器皿中的培养基（如果细胞生长良好，密度适宜，则不用换液）

c 在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液

d 混匀后放于二氧化碳培养箱（37℃、5%CO₂）孵育过夜

注：感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大，所以务必保证加病毒之前，细胞处于良好的生长状态。

如果慢病毒对目的细胞的感染效率偏低，则可以通过提高MOI 值来增加其感染效率，但是当MOI 高于20 时，我们建议客户在培养基中加入ploybrene（8 μg/ml左右）来提高病毒的感染效率。

第三天，更换培养液：一般在24小时候后将含有慢病毒的培养液更换成正常培养液；在感染后观察细胞状态，如果慢病毒对细胞有明显毒性作用而影响细胞生长状态，可以最短在加病毒4小时候更换新鲜培养液后继续培养（建议在8-12小时更换为宜）。第一次换液后，如果慢病毒对细胞没有明显毒性作用，按照正常培养条件培养换液。

第六天，感染效率检测：在倒置荧光显微镜观察荧光，估计慢病毒感染目的细胞的效率；如何由于目的基因较大而造成选择的载体不能携带Marker Gene的，可以通Real-time RT-PCR检测目的基因的表达来拍评估感染效率。

三、慢病毒使用注意事项

1. 病毒操作时最好使用生物安全柜。如果使用普通超净工作台操作病毒，请不要打开排风机。

2. 病毒操作时请穿实验服，带口罩和手套。

3. 操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS 溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84 消毒液或1%SDS 中浸泡过夜后弃去。

4. 用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤：拧紧培养瓶或盖紧培养板。用70%乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验台之前，用70%乙醇清理显微镜实验台。

5. 如需要离心，应使用密封性好的离心管，或者用封口膜封口后离心，而且尽量使用组织培养室内的离心机。

6. 脱掉手套后，用肥皂和水清洗双手。

四、悬浮细胞感染简单步骤

1. 根据细胞的量将细胞在1.5ml 管中离心收集然后用100-200ul 的无血清培养液稀释细胞沉淀，以细胞完全浸没在培养基中为准

2. 按照MOI 换算病毒颗粒数量，吸取病毒液加入细胞中，将1.5ml 管放在37℃度培养箱中孵育30 分钟

3. 将管中混合溶液吸出加到培养皿中或孔里

4. 加入足够量的新鲜培养液

5. 12 小时后换液

6. 96 小时后观察细胞阳性率