磁珠纯化---使核酸高通量纯化成为可能

随着分子生物技术的发展，科研及临床检测要求的提高，核酸纯化方法也经历了密度梯度离心，酚氯仿、苯酚、异戊醇抽提，二氧化硅吸附等化学物理方法。目前，基于硅胶膜对核酸特异结合的原理所开发的方法已成为核酸纯化的主流方法。为了减少化学、物理因素对核酸的破坏和降解，科学家们力求开发快速、温和的纯化方法，在确保遗传信息的完整性同时，提高工作效率。而KingFisher磁珠纯化法不仅满足了科研工作者对核酸质量的高要求，同时其自动化、通量高、速度快、灵敏度高的特性也提高了科研工作者的工作效率。目前转移磁珠的磁珠纯化方案正在逐步替代以往的各种方法，特别是目前普遍应用的离心柱法。

酚法抽提、玻璃珠沉淀法、离心柱法与磁珠法：

经典的核酸纯化法采用酚、氯仿抽提，样品经过处理后分为水相和有机相，通过酒精离心沉淀水相中核酸的方法纯化样品中的核酸，这就是我们所说的酚-率氯仿抽提法。酚法抽提相对稳定，至今仍被多数科技工作者广泛应用，也是其他多种提取方法的操作基础。

随后，科学家发现核酸与硅存在特异结合，并开发了用玻璃珠吸附核酸，离心沉淀后经过洗和洗脱得到纯化的核酸样品，因玻璃珠比重较大，容易离心到管底，从而缩短了离心时间，目前此方法仍被部分实验室采用。

后来科学家将玻璃珠改成玻璃纤维，并将玻璃纤维制成薄膜状，置于离心管中层，用离心的方法从裂解液中吸附，这就是目前核酸纯化的主流方法--离心柱法。离心柱法极大简化了操作流程、缩短操作时间，目前已成为大多数实验室主流纯化方法；但离心柱法样品与硅介质结合时间短，样品回收率低，并对样品有一定的损伤。

 

 以上提到的三种方法都是需要离心操作的纯化方法（图1），每一批样品的提取都涉及到开关离心管盖、废液处理、加液的操作，不仅引入了人为误差，也容易在大批量样品处理时造成交叉污染。而应用磁珠纯化技术，则可以利用磁铁特异吸附磁珠（图2A），从而省去离心操作，减少人为操作环节，避免人为误差，不仅节省时间，同时使高通量纯化成为可能。

Thermo Scientific KingFisher转移磁珠纯化方案的专利设计

无论离心柱过滤法还是磁珠法，都是基于硅介质与核酸特异结合的原理而发展起来的。离心柱法所采用的硅胶膜实际上就是玻璃纤维，而磁珠之所以能够结合核酸也是因为其表面包被了玻璃纤维。而磁珠纯化法本身也经历了转移液体的磁珠纯化和转移磁珠的磁珠纯化两个阶段。

最初的设计是用磁力架将磁珠吸附在管内壁，随后将不含磁珠的液体吸走，达到结合、洗涤、洗脱的目的（图2B）。但转移液体需要吸头移液操作，首先会有大量的液体残留，其次吸液时会损耗一些磁珠，降低磁珠回收率，再者吸液操作的废液处理及移液过程中容易产生交叉污染。

为了弥补转移液体方案的不足，赛默飞世尔科技开发了一种转移磁珠的纯化方案。与转移液体的方案不同，转移磁珠方案用磁力棒吸附、转移磁珠，省去了移液操作，缩短了由移液带来的操作时间（图2C）；同时在保证磁珠完全回收转移的同时，使液体残留量降至最低水平；从而提高了样品纯度和后续检测灵敏度。

公司的研发团队将这种技术命名为KingFisher技术 （专利号US 6447729, US 6448092）。KingFisher在英文中是翠鸟的意思，美国的动物行为学家发现，KingFisher（翠鸟）可以从复杂的河流环境中捕食自己喜欢吃的鱼类，而磁力棒吸附、转移磁珠的操作就像KingFisher从河中捕鱼一样，因此将这种技术命名为KingFisher磁珠纯化法。

Thermo Scientific KingFisher磁珠纯化仪的超强兼容性与延展性

KingFisher磁珠自动纯化系统是一套完全开放的体系，几乎兼容所有市面上可以查到的，进口及国产基于磁珠法的纯化试剂盒，如：OMEGA、Qiagen、Ambion、Invitrogen、Invitek等进口品牌，以及天根、博坤、易瑞等国产试剂盒。应用这些多种多样的试剂盒，研究人员可以方便的从普通样品如：血液、体液、动植物组织、培养细胞、细菌等，以及疑难样品如：土壤、粪便、毛发、FFPE、唾液、法检痕量样品中，自动化快速提取高产量、高质量、高完整度的DNA、RNA样品。在 KingFisher Flex 系统上利用磁珠纯化方法提取的核酸样品可以直接进行核酸定量、实时荧光定量PCR仪检测、测序、芯片检测等下游实验，无需再纯化。从样品到纯化产品，只需15-45分钟（根据样本类型和试剂盒程序略有不同），并且可与其它仪器（包含第三方仪器）整合，提供无限扩展空间和真正意义的实验室自动化。 

图3 磁珠核心结构。KingFisher系列产品可以帮助科技工作者从复杂的各种类型的原始样品中，精确提取所需要的目的分子或细胞。
 

值得注意的是，KingFisher磁珠纯化仪所能做的事情绝不仅限于核酸提取，应用不同包被物包被的磁珠，可以从复杂的样品中提取高纯度的DNA、RNA、蛋白、抗体、细菌、细胞等（图3）。也可以根据不同的用户需要，在磁珠表面标记所需要的诱饵分子，从复杂的样品中钓取所需的单一目的分子或细胞。 

Thermo Scientific KingFisher系列磁珠自动纯化仪

目前，KingFisher磁珠自动纯化系列产品主要拥有15个样品通量的“KingFisher mL”；24个样品通量的“KingFisher”；和兼容24/96个样品通量的“KingFisher Flex”，可以满足不同样品数量用户的样品处理需求（图4）。KingFisher系列产品可以在15-45分钟内完成多达96个样品的平行纯化处理，在高通量的基础上保证样品纯度和检测灵敏度。

 

KingFisher磁珠纯化仪作为一种新型的纯化方案，已经成为一种科研以及应用趋势，逐步取代以往的柱法提取，目前已风靡欧美。至今在中国市场，KingFisher纯化仪也已经被各地高校、研究所、各科研机构、大批量种子检测、疫病监控、流行病控制、血液初筛、血库建库、高通量基因测序等机关、部门、企业广泛采纳，逐步成为核酸提取的主流应用方法。

应用实例

1、KingFisher的磁珠回收率：KingFisher 96 DW Plate板型与加热块匹配嵌合的独特设计也保证加热的最大效率。如果用其它型号的96孔板，热块会抬升板底高度，从而影响混匀操作甚至造成仪器不稳定性。实验数据表明96 DW Plate的磁珠回收率比其他96孔板的回收率更高。使用96 DW Plate进行磁珠孔到孔的水平转移，其回收率高达99.4%（图 5）。

2、血液DNA提取：用ThermoFisher Scientific “KingFisher Blood DNA Kit”从多至3-8 ml全血中提取DNA。产物回收率、纯度、完整度均达到高水平（图 6）。全过程约45-60分钟。

3、动物组织DNA提取：应用OMEGA MagSi Tissue DNA Kit，实验者可以方便的从10 mg动物组织中提取样品DNA（图 7）。样品预处理后在KingFisher上的运行时间大约30 分钟。

 

4、植物组织RNA提取：应用OMEGA MagSi Plant RNA Kit，实验者可以在60分钟内，从50 mg植物组织中，一次纯化96个平行样品（图 8）。