免疫组化实用案例第二课
丁香园
DAB染色后切片着色呈阴性结果
背景:其实免疫组化在DAB染色后一般有四种情况:阳性染色效果很好、阴性染色、非特异性染色很深、阴阳脸(染色不均匀)。
而阴性染色是许多初学者经常遇到的头疼问题。我身边有个研究生同学在我们实验室初次涉入免疫组化,听说步骤不难,跟我后面做了几次之后,就自己开始做了,连续做了三次,结果均是阴性染色。很扫兴,不知是什么原因导致的。
问题及其解答:
免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些?
1、抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。不知抗体是进口的还是国产的工作液,怎么这么高稀释度也没能做出阳性结果?另外,不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果,抗原抗体反应有前带和后带效应,必须摸索最佳浓度。
2、抗原修复不全,对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位,以利于与抗体结合;建议微波修复用高火4次6min试试。有人做过实验,这是最佳的时间和次数。若不行,还可高压修复。
3、组织切片本身这种抗原含量低;
4、血清封闭时间过长。
5、DAB孵育时间过短。
6、细胞通透不全,抗体未能充分进入胞内参与反应。
7、开始做免疫组化,我建议你一定要首先做个阳性对照片,排除抗体等外的方法问题。
我的解决方案:
第一步
排除组织切片内的抗原有无丢失及其含量多少。免疫组化中两个最重要的因素是抗原和抗体。
(1)抗原有无丢失主要看组织切片的新鲜程度,一般切片室温保存超过3-6个月,可能切片内的抗原丢失很严重(有文献支持),此时可以通过重新用石蜡块切片来进一步验证(蜡块需要低温保存)。
(2)石蜡切片在制作过程中可能因醛基对抗原决定族的封闭,这需要通过抗原修复来充分暴露,从而增加抗原抗体结合反应,提高阳性率,我一般用6miundefined4次中火微波抗原修复,用枸橼酸钠缓冲液。
(3)组织切片中本身抗原含量的多少?这方面我有教训的,我做胎鼠睾丸间质细胞鉴定,用1:200一抗效果很好;但我用1:200一抗孵育成年睾丸间质细胞检测,几乎呈阴性,后来证实是因为两者抗原含量相差甚远,则一抗也要适当提高浓度。
第二步
检查抗体有无选择错误和抗体孵育条件是否不适。
(1)一抗选择单克隆抗体易出现阴性结果,因为灵敏度低但特异性好;一抗的species reactivity中无检测组织的种属,这是比较常见的错误;一抗选择rat,而二抗是抗mouse/rabbit等均有可能出现阴性结果。
(2)抗体孵育时间过短,容易导致阴性结果。一般一抗我建议4度孵育过夜和37度复温45min;二抗我一般37度30min。我不喜欢参照二抗染色试剂盒说明书。
(3)抗体浓度过低。这是阴性结果的最可能原因。必须提高稀释度,我一般初次做一种新抗体,喜欢先用说明书建议的低浓度和高浓度做一次,然后决定是向高还是低方向摸索。一般先决定二抗的浓度(工作液就好办了,直接滴加),重点摸索一抗的最适浓度。注意:免疫反应中存在前带和后带效应,这提示不是浓度越高,阳性率就越高,反之亦然。
(4)重要原因排除之后,也不要忽视抗体的质量:原装抗体一般比较稳定,效果较好;而进口分装次之;工作液可能要注意质量问题。
第三步
DAB的孵育时间可能要适当延长,在镜下观察,有时可延长至30min。但一般3-10min最好,此时背景也较浅。否则,说明抗体浓度不合适。
第四步
血清封闭时间也可相应缩短。一般10-30min,但这个时间可以调整,封闭主要是降低切片的总体背景着色。
此外,细胞通透也不可忽视。
许多战友认为石蜡切片一般不需细胞通透,因为切片时可能已经把细胞切开了,但对于胞核蛋白,建议还是通透一下,促进抗体等试剂充分进入参与反应。
最后,以上原因,都是针对实际中常见原因来进行分析的,前提是排除操作者的操作错误而引起阴性结果,这就需要新手还是要设置阳性对照以排除方法的问题。还有抗体稀释液的PH值过低等其它原因的干扰。
总之,要想把免疫组化做好,可能每一个环节都很重要,但也存在主次之分,出现问题了,需要通过先排除主要的,再依次排除次要的——这是衡量你对免疫组化原理掌握与否的关键所在。
本文来源于丁香园论坛,为站友:wh2008 原创
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