Annexin V凋亡流式双染与Tunel凋亡免疫组化案例介绍

原位末端凋亡法（Tunel）实验服务

TUNEL实验技术简介：TUNE技术，即脱氧核苷酸末端转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT )介导的2dUTP 缺口末端标记(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL ) 技术是目前原位检测细胞凋亡最敏感、快速、特异的新方法， 已广泛用于生物、医学研究领域。

TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL)是一种用来检测细胞凋亡(apoptosis)的分析方法。细胞凋亡有一项重要的特征为细胞内的DNA会碎裂成片段(DNA fragmentation)，TUNEL可以有效的去探测DNA片段的产生，所以可以传达细胞凋亡的讯息。

TdT为terminal deoxynucleotidyl transferase，此种酵素可以在没有DNA模板的情形下，连结核甘酸到DNA的3'-OH处。1992年，以色列科学家Gavrieli等人将TdT引为为标定DNA片段的一个酵素，自此衍生出TUNEL此项技术。

TUNEL的好处是可以在细胞凋亡发生的早期，即可侦测到DNA片段的产生，并且可以直接使用在组织切片上，观察细胞凋亡发生的位置。所以TUNEL目前为广泛接受与使用的一种细胞凋亡的分析方法。

实验服务注意事项

1. 实验委托者提供实验分组情况及实验背景资料，有具体要求请事先说明；

2. 实验委托者可提供组织块（以中性福尔马林或多聚甲醛固定，如组织块极小请事先说明）、蜡块或切片（使用免疫组化专用切片，以避免实验过程中掉片）；

3. TUNEL染色完毕后，照相1-2张/每切片，如需要图片分析请事先说明；

4. TUNEL试剂盒的购买：事先咨询嘉美生物，明确是否有该抗体可使用，如无则由双方协商公司代购。

标本收集、保存、运输

1. 组织标本：事先应以10%的福尔马林或4%的多聚甲醛固定（后者同时适合免疫荧光检测）；

2. 细胞检测：由实验室负责准备检测样本，实验委托者提供细胞或实验室负责提供细胞；

3. 样本运输：样本密封完毕，建议以塑料瓶装好标本寄送以免路途损坏；如寄送切片则选择纸盒包装完好，周围加以泡沫或纸巾填塞以免路途损坏，常温寄送即可。

Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染流式检测实验服务

原理：在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡最早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、DNA片断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。

Annexin V是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

案例介绍： 抗肿瘤药物细胞干预培养以及细胞凋亡检测

细胞：人肺癌A549细胞

药物：a、b、c三种药物干预24h

实验分组:

A组：细胞中加入药物a，培养24h后，细胞凋亡Annexin V/PI双染流式检测；

B组：细胞加入药物b，培养24h后，细胞凋亡Annexin V/PI双染流式检测；

C组：细胞加入药物c，培养24h后，细胞凋亡Annexin V/PI双染流式检测；

D组：细胞正常培养，培养24h后，细胞凋亡Annexin V/PI双染流式检测；