核糖体失活展示系统
丁香园
4684
1. 介绍
在过去的 10 年里，几种展示系统为多肽和蛋白质的选择及进化提供了强大而高效的技术。在这些技术中，将基因型和表现型相联系是最关键的决定因素。在这样的选择系统里，文库成员特异的序列信息（基因型）编码了被选择的蛋白质（表现型），它们是由引进这个系统的相应的 DNA/RNA 决定的。然后，编码被选择蛋白质的基因被再次扩增，以便进行下一轮的进化和筛选。这个策略被成功地发展起来：其一是细胞依赖型，包括展示在噬菌体的表面 [1]、其他病毒的表面 [2]、细菌的表面 [3]、酵母的表面；其二是无细胞型，如核糖体展示系统 [5~7] 以及信使 RNA ( mRNA) 展示系统 [ 8，9] 。
然而，现在发展起来的方法，都难免具有一些局限性和缺点。因为细胞依赖型展示系统 [ 1 〜 4 ] 包括了必需的体内步骤、转化效率和蛋白质性质限制了序列文库的大小和多样性。例如，一些对细胞有害的蛋白质，或者在细胞中发挥重要调节功能的蛋白质就不能被选择。在核糖体展示系统中 [5 〜 7] ，核糖体和翻译出的蛋白质、编码蛋白质的 mRNA 形成一个稳定的复合体，这是因为去掉密码子，添加 Mg ( OAc)2 和反义-ssrA 多核苷酸 [ 6，7 ] ，可以使蛋白质从复合体中释放的速度减慢。但是，在一轮核糖体展示后脱离下来的 mRNA 量不是很高。用来替代的无细胞型 mRNA 展示程序 [ 8，9]，需要精细地合成以及严格地纯化连接嘌呤霉素的寡聚核苷酸，这段核苷酸片段将被连接到 mRNA 文库序列的 3' 端。任何不恰当的操作都将导致文库多样性的降低。
为了解决上述问题，保持序列文库的多样性，我们发展了一种新策略，得到蛋白质-核糖体-mRNA 三元复合体，它比用传统方法得到的复合体更稳定（图 13.1) 。 这种稳定性是通过在被翻译成蛋白质文库的序列文库的下游区域引进一种可以使真核细胞核糖体失活的毒素基因——蓖麻蛋白 A 链（RTA ) 来实现的（图 13.1) 。 蓖麻蛋白是
由 A 链、B 链组成的植物毒素，它能使核糖体失活以抑制蛋白质的合成。B 链是蓖麻蛋白通过内化作用进入细胞时必需的。真核核糖体大亚基的 23S〜28S 核糖体 RNA ( tRNA ) 上有一个 GAGA 四碱基环，蓖麻蛋白的活性部分 RTA 催化水解邻近其中一个普遍保守的腺嘌呤的 N-糖苷键 [ 10，11] 。这个单点脱嘌呤改变了与延伸因子的
结合位点，抑制了蛋白质合成，使翻译复合体上的核糖体还没有释放 mRNA 或翻译蛋白就失活 [ 12〜14 ]。由于翻译在到达终止密码子之前就停止了，核糖体就不用招募释放因子。因此，mRNA 和初生蛋白质仍旧非常稳定地结合在核糖体上，不只是数小时，而且是数天。特别的是，RTA 每分钟可以使约 1500 个核糖体失活 [ 15 ]，因此，在标准的翻译条件下能够快速形成极其稳定的蛋白质-核糖体-mRNA 复合体。所以，核糖体失活展示系统 （RIDS) 的关键之处就在于，mRNA 上的核糖体通过与原先的核糖体展示系统完全不同的机制而失活。利用这种方法，我们能够在标准的翻译条件下筛选功能蛋白，而不需要去除终止密码子。
为了评估 RIDS 潜在的应用价值，我们选择链霉亲和素和谷胱甘肽转移酶 ( GST ) 作为目标蛋白，用分别含有生物素或谷胱甘肽做配体的基质分离各自的蛋白质和 mRNA。我们发现，利用 RIDS 达到目的是可能的，即在不降低序列文库多样性，不需要化学合成的情况下，筛选出功能蛋白（链霉亲和素和 GST )。如果向 RIDS 中引进互补的 DNA (cDNA) 文库或者随机 DNA 文库替代模式蛋白（链霉亲和素或 GST) ，那么我们就可以选择出功能蛋白。
2. 材料
( 1 ) pET30a ( Novagen，Darmstadt，Germany)。
( 2 ) cDNA 文库或随机 DNA 文库。
( 3 ) 链霉亲和素和 GST 基因。
( 4 ) RTA 基因。
( 5 ) 来源于 pCANTAB 5E ( Amersham Biosciences ， fiscataway， NJ ) 的 fd 噬菌体基因 Ⅲ。
( 6 ) 多核苷酸引物和连接子。
( 7 ) T7 Ampliscribe™ 试剂盒（Epicentre Technologies，Madison，WI)。
( 8 ) 帽子结构的类似物（New England Biolabs，England)。
( 9 ) DNase I ( Epicentre Technologies, Madison, WI)。
( 10 ) RNeasy™mini 试剂盒（QIAGEN，Hilden，Germany)。
( 11 ) Flexi® 兔网织红血球裂解系统（Promega，Madison, WI)。
( 12 ) Recombinant RNasin® 核糖核酸酶抑制剂（Promega)。
( 13 ) 结合（或漂洗）缓冲液：140 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10.1 mmol/L Na2HPO4、1.8 mmol/L KH2PO4、0.04% Tween-20、2% Block Ace™( Dainippon Pharmaceutical Co. ；Japan)、5 mmol/L MgCl2，pH 7.3。可以在 -20°C 储存一个月。
( 14 ) 选择用的配体珠子。
( 15 ) 生物素琼脂糖（Sigma，St. Louis，MO)、谷胱甘肽凝胶 4B (Amersham Biosciences)。
( 16 ) 洗脱缓冲液：1 mol/L NaCl、50 mmol/L EDTA。
( 17 ) ReverTra Dash® (Toyobo, Japan)。
( 18 ) KODDash® (Toyobo)。
4. 注
1. 与标准的兔网织红血球裂解系统相比，Flexi 兔网织红血球裂解系统提供了更灵活的反应条件。在展示含有二硫键的蛋白质时要去掉还原剂（包括 DTT )。根据核糖体展示方法优化 Mg2+ 和 K+ 的浓度。
2. 我们发现有时亲和选择 GST 时，若用谷胱甘肽凝胶，会检测到高背景。但是，若用抗 GST 抗体替代谷胱甘肽凝胶，则没有背景。这个结果表明可能因为空间阻隔的存在，在核糖体上展示的几个 GST 不能二聚化，而仅有的 GST 二聚体能够识别谷胱甘肽。
3. 添加 5~50 mmol/L MgCl2 能够稳定核糖体复合体。
4. 尽管我们能够在室温下从 GST 和链霉亲和素的混合物中成功选择出 GST 或者链霉亲和素，但是有时候能够检测到非特异性结合。似乎冷却翻译混合体系能够稳定核糖体复合体。惊奇的是，虽然存在终止子，但是向结合缓冲液中添加 MgCl2、冷却翻译混合物，能使少量 StAav-mR mRNA 结合到生物素琼脂糖上。似乎在存在终止子的核糖体展示系统中形成了 mRNA-核糖体-蛋白质复合体。
参考文献
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在过去的 10 年里，几种展示系统为多肽和蛋白质的选择及进化提供了强大而高效的技术。在这些技术中，将基因型和表现型相联系是最关键的决定因素。在这样的选择系统里，文库成员特异的序列信息（基因型）编码了被选择的蛋白质（表现型），它们是由引进这个系统的相应的 DNA/RNA 决定的。然后，编码被选择蛋白质的基因被再次扩增，以便进行下一轮的进化和筛选。这个策略被成功地发展起来：其一是细胞依赖型，包括展示在噬菌体的表面 [1]、其他病毒的表面 [2]、细菌的表面 [3]、酵母的表面；其二是无细胞型，如核糖体展示系统 [5~7] 以及信使 RNA ( mRNA) 展示系统 [ 8，9] 。
然而，现在发展起来的方法，都难免具有一些局限性和缺点。因为细胞依赖型展示系统 [ 1 〜 4 ] 包括了必需的体内步骤、转化效率和蛋白质性质限制了序列文库的大小和多样性。例如，一些对细胞有害的蛋白质，或者在细胞中发挥重要调节功能的蛋白质就不能被选择。在核糖体展示系统中 [5 〜 7] ，核糖体和翻译出的蛋白质、编码蛋白质的 mRNA 形成一个稳定的复合体，这是因为去掉密码子，添加 Mg ( OAc)2 和反义-ssrA 多核苷酸 [ 6，7 ] ，可以使蛋白质从复合体中释放的速度减慢。但是，在一轮核糖体展示后脱离下来的 mRNA 量不是很高。用来替代的无细胞型 mRNA 展示程序 [ 8，9]，需要精细地合成以及严格地纯化连接嘌呤霉素的寡聚核苷酸，这段核苷酸片段将被连接到 mRNA 文库序列的 3' 端。任何不恰当的操作都将导致文库多样性的降低。
为了解决上述问题，保持序列文库的多样性，我们发展了一种新策略，得到蛋白质-核糖体-mRNA 三元复合体，它比用传统方法得到的复合体更稳定（图 13.1) 。 这种稳定性是通过在被翻译成蛋白质文库的序列文库的下游区域引进一种可以使真核细胞核糖体失活的毒素基因——蓖麻蛋白 A 链（RTA ) 来实现的（图 13.1) 。 蓖麻蛋白是
由 A 链、B 链组成的植物毒素，它能使核糖体失活以抑制蛋白质的合成。B 链是蓖麻蛋白通过内化作用进入细胞时必需的。真核核糖体大亚基的 23S〜28S 核糖体 RNA ( tRNA ) 上有一个 GAGA 四碱基环，蓖麻蛋白的活性部分 RTA 催化水解邻近其中一个普遍保守的腺嘌呤的 N-糖苷键 [ 10，11] 。这个单点脱嘌呤改变了与延伸因子的
结合位点，抑制了蛋白质合成，使翻译复合体上的核糖体还没有释放 mRNA 或翻译蛋白就失活 [ 12〜14 ]。由于翻译在到达终止密码子之前就停止了，核糖体就不用招募释放因子。因此，mRNA 和初生蛋白质仍旧非常稳定地结合在核糖体上，不只是数小时，而且是数天。特别的是，RTA 每分钟可以使约 1500 个核糖体失活 [ 15 ]，因此，在标准的翻译条件下能够快速形成极其稳定的蛋白质-核糖体-mRNA 复合体。所以，核糖体失活展示系统 （RIDS) 的关键之处就在于，mRNA 上的核糖体通过与原先的核糖体展示系统完全不同的机制而失活。利用这种方法，我们能够在标准的翻译条件下筛选功能蛋白，而不需要去除终止密码子。
为了评估 RIDS 潜在的应用价值，我们选择链霉亲和素和谷胱甘肽转移酶 ( GST ) 作为目标蛋白，用分别含有生物素或谷胱甘肽做配体的基质分离各自的蛋白质和 mRNA。我们发现，利用 RIDS 达到目的是可能的，即在不降低序列文库多样性，不需要化学合成的情况下，筛选出功能蛋白（链霉亲和素和 GST )。如果向 RIDS 中引进互补的 DNA (cDNA) 文库或者随机 DNA 文库替代模式蛋白（链霉亲和素或 GST) ，那么我们就可以选择出功能蛋白。
2. 材料
( 1 ) pET30a ( Novagen，Darmstadt，Germany)。
( 2 ) cDNA 文库或随机 DNA 文库。
( 3 ) 链霉亲和素和 GST 基因。
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( 6 ) 多核苷酸引物和连接子。
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( 9 ) DNase I ( Epicentre Technologies, Madison, WI)。
( 10 ) RNeasy™mini 试剂盒（QIAGEN，Hilden，Germany)。
( 11 ) Flexi® 兔网织红血球裂解系统（Promega，Madison, WI)。
( 12 ) Recombinant RNasin® 核糖核酸酶抑制剂（Promega)。
( 13 ) 结合（或漂洗）缓冲液：140 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10.1 mmol/L Na2HPO4、1.8 mmol/L KH2PO4、0.04% Tween-20、2% Block Ace™( Dainippon Pharmaceutical Co. ；Japan)、5 mmol/L MgCl2，pH 7.3。可以在 -20°C 储存一个月。
( 14 ) 选择用的配体珠子。
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( 17 ) ReverTra Dash® (Toyobo, Japan)。
( 18 ) KODDash® (Toyobo)。
4. 注
1. 与标准的兔网织红血球裂解系统相比，Flexi 兔网织红血球裂解系统提供了更灵活的反应条件。在展示含有二硫键的蛋白质时要去掉还原剂（包括 DTT )。根据核糖体展示方法优化 Mg2+ 和 K+ 的浓度。
2. 我们发现有时亲和选择 GST 时，若用谷胱甘肽凝胶，会检测到高背景。但是，若用抗 GST 抗体替代谷胱甘肽凝胶，则没有背景。这个结果表明可能因为空间阻隔的存在，在核糖体上展示的几个 GST 不能二聚化，而仅有的 GST 二聚体能够识别谷胱甘肽。
3. 添加 5~50 mmol/L MgCl2 能够稳定核糖体复合体。
4. 尽管我们能够在室温下从 GST 和链霉亲和素的混合物中成功选择出 GST 或者链霉亲和素，但是有时候能够检测到非特异性结合。似乎冷却翻译混合体系能够稳定核糖体复合体。惊奇的是，虽然存在终止子，但是向结合缓冲液中添加 MgCl2、冷却翻译混合物，能使少量 StAav-mR mRNA 结合到生物素琼脂糖上。似乎在存在终止子的核糖体展示系统中形成了 mRNA-核糖体-蛋白质复合体。
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