基于钙调素与荧光蛋白融合的钙指示剂
丁香园
3461
1. 介绍
Ca2+ 浓度（[ Ca2+ ] ) 变化涉及细胞过程，如细胞发育、分化和凋亡，在它们存在的时空环境中研究这些变化，可以深入地了解它们的生物学意义。合成染料（ 如 Fura 和 Indo) 和发光蛋白（aequorin) 是研究 [Ca2+] 变化的常用工具，但是，多数合成染料迅速从细胞中流失，发光蛋白只有微弱的生物光且不能按比例显示[Ca2+] 的变化[ 1 ] 。相反，蛋白质 Ca2+ 传感器基于 Ca2+- 钙调素复合物和绿色荧光蛋白（起先被命名为钙变色子）克服了原先的这两个限制 （ 见注 1 )。本章我们描述包括钙变色子克隆、生化特性的鉴定和用数字荧光显微镜在单个细胞中成像的有关方法。在我们能够描述这些方法之前，必须理解荧光共振能量转移理论（ FRET ; 见 4.1.1 ) 和对钙变色子的一般设计（见 4.1.2)。
1.1 FRET ( 荧光共振能量转移）的概念
FRET 是能量从给体荧光团到受体荧光团的转移。如果给体的发射谱与受体的激发谱严重重叠，这种转移就能够发生。这种能量转移在距离小于 80 A 时发生，并当两个荧光团靠得最近且取向平行时效率最高 [2，3] 。在设计钙变色子时，用 GFP 突变体作为两个伙伴荧光团：蓝绿色荧光蛋白作为给体，而黄色荧光蛋白作为受体（见图4.1 ; 参考文献 [4])。如果两个荧光团融合于不同的作用伙伴，分子间 FRET 可以用来探测蛋白质-蛋白质相互作用，而如果两个荧光团都融合到同一个蛋白质，分子内 FRET 可用来探测蛋白质剪切和构象变化 [3] 。
4.1.2 钙变色子的一般设计
使用分子内 FRET 的概念，钙变色子由夹在 CFP 和 YFP 之间的，前后融合的 CaM 的 N 端和 C 端结构域（分别记为 N-CaM 和 C-CaM ) 以及 CaM 识别序列（CRS) 组成 [5~7] 。CRS 的位置取决于它的结合取向，它或者放在 CaM 的 N 端、CaM 的 C 端，或者放在 N-CaM 和 C-CaM 之间 [ 见图 4.2 ( A ) 和注 2] 。在 Ca2+ 流入之后，CaM 结合到 CRS 上，引起构象变化，拉近 CFP 和 YFP，以增加 FRET 效率（见图4.2B)。已用 CFP-YFP 作 FRET 伙伴，制造出数种黄色的钙变色子（YC ) ，它们具有不同的 Ca2+ 亲和力、亚细胞定位和动态范围。本章提供的方法适用于所有已发表的用于 Ca2+ 成像的 YC，包括 YC2.1，它基于 CaM 结合到肌球蛋白轻链激酶 CRS 肽上的结构 ( MLCKp；参考文献 [7])；YC3.1，CaM 的单点突变 E104Q 降低了 Ca2+ 亲和力 [7]； YC2nu，以核为目标；YC6.1，基于改善了动态范围的，CaM 结合于 CaM 依赖激酶的激酶 CRS 肽（CKKp) 的结构。
2. 材料
2.1 钙变色子的克隆
( 1 ) PRSETB 细菌表达质粒（Invitrogen ) : 用于 Ni-次氮基三乙酸（NTA ) 琼脂糖蛋白纯化的 His-tag；用于选择的氨苄青霉素和用于诱导蛋白质表达的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG )。
( 2 ) pcDNA3 哺乳动物瞬时表达质粒（Invitrogen ) : 巨细胞病毒启动子和用于细菌选择的氨苄青霉素抗性基因。
2.2 生物化学和生物物理鉴定
( 1 ) Luria-Bertani ( LB ) 培养基：10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母提取液和 5 g 氯化钠；加入水至终体积 1 L。
( 2 ) IPTG。
( 3 ) 苯甲基横酰基氟化物。
( 4 ) Ni-NTA 琼脂糖（Qiagen)。
( 5 ) 大肠杆菌菌株 BL21 ( DE3 )。
( 6 ) 超声发生器。
( 7 ) EGTA 缓冲液：100 mmol/L 氯化钾，50 mmol/L pH 7.4 的 HEPES 和 10 mmol/L EGTA。
( 8 ) 氯化钙缓冲液：100 mmol/L 氯化钾，50 mmol/L pH 7.4 的 HEPES，10 mmol/L EGTA；和 10 mmol/L 氯化钙。
( 9 ) 荧光光谱仪（Shimadzu)。
2.3 钙变色子的成像
( 1 ) 含 10% 胎牛血清（FBS) 的 Dulbecco 的修饰 Eagle 培养液（DMEM )。
( 2 ) 含 Ca2+ 的 Hank's 平衡盐溶液（Gibco)。
( 3 ) 37°C 二氧化碳培养箱。
( 4 ) HeLa 细胞株。
( 5 ) Genejuice (Novagen)。
( 6 ) 奥林巴斯 IX70 倒置表面荧光显微镜。
( 7 ) 奥林巴斯氙灯。
( 8 ) MicroMax 1300YHS 电荷耦合器件（CCD) 照相机和 Metafluor 4.5r2 软件控制的 Sutter Lambda 10-2 滤镜转换器。
( 9 ) CFP- YFPFRET 滤镜组（Omega Optical ; 见注 3 ): 440AF21 激发滤镜（CFP 激发），455DRLP 二色镜，480AF30 发射滤镜（CFP 发射）和 535AF26 发射滤镜 ( YFP 发射)。
( 10 ) 中性密度滤镜（ND) 组（Omega Optical)。 .
( 11 ) UApo X 40 油 Iris/340 物镜（奥林巴斯）。
( 12 ) U-MNIBA 带通直角镜单元（奥林巴斯）。
( 13 ) 组胺，离子霉素，EGTA 和 BAPTA-AM (Sigma)。
( 14 ) 35 mm 直径玻璃底皿（Maltek)。
4. 注
1. 钙变色子不是没有它们自身的局限。通常，它们比提到的其他方法有较低的信噪比。但是，正如文中所述，信噪比可通过仔细设计新的建构 [5 ] 或通过优化实验条件来改善。
2. 插入 CRS 的最好的地方，依赖于三维结构中，两个 CaM 结构域相对于 CRS 的排布。如果在 CaM-CRS 复合物中，CRS 的 N 端在 CaM 的 C 端的 20A 之内，CaMCRS 融合就是有效的 [6] 。但是，如果 N 端和 C 端都在 CaM 铰链的 10A 之内，（NCaM) -CRS- ( C-CaM) 融合会是最有效的。
3. 如果在自己的应用中只对使用 CFP 和 YFP 感兴趣，CFP-YFP FRET 滤光组合会满足你的需求。如果你想在FRET 中使用 Discosom 红色荧光蛋白 CdsRed；参考文献 [ 12 ] 和 [13])，需要下列来自 Omega Optical 的或类似的双色镜和滤光镜：双色镜 450-520-590 TBDR 用于二色镜；440DF21 用于 CFP 激发；510DF23 用于 YFP激发；575DF26 用于 dsRed 激发。480AF30 用于 CFP 发射；535AF 26 用于 YFP 发射；600ALP 用于 dsRed发射。这一滤镜组允许你激发和接收单独来自 CFP、YFP 和 dsRed 的光，但效率会有降低。
4. 在钙变色子的建构中，我们切除了 CFP 的 C 端 11 个氨基酸（形成 GFP 极小域），以减少荧光团的相对翻滚。甚至，把氨基乙酸-甘氨酸连接引入 CaM 和 CRS 融合蛋白中，以增加 Ca2+ CaM-CRS 复合物的构象自由度。
5. 在为插入 PRSETB 或 pcDNA3 而用聚合酶链反应扩增钙变色子 DNA 时，记住钙变色子的 5' 和 3' 引物会有内引物位点，因为，CFP 和 YFP 只有几个点突变的差别。需从琼脂糖胶上纯化大小正确的 DNA 片段。
6. 如果你的实验中钙变色子降解或在细菌细胞中不溶，可以用哺乳细胞降解物完成鉴定。为收获产物，细胞应生长在直径为 10 cm 的培养皿中。转染 24 h 后，把细胞刮出培养皿并在低渗的破解缓冲液（50 mmol/L HEPES，pH 7.4 和 100 mmol/L 氯化钾；5 mmol/L 氯化镁和 0.5% Triton X-100 ) 中破碎。然后离心混合物以去除碎片。下一步，在 2 L 缓冲液（50 mmol/L HEPES，pH 7.4 和 100 mmol/L 氯化钾）中透析上清液。最后，样品可用于鉴定，如 4.3.2.2 和 4.3.2.3 节所述。
7. Ca2+ 结合曲线的精度取决于 Ca2+/EGTA 缓冲液的精确配制 [9]。
8. 由于光漂白作用，实验过程中发射强度会增加；但是，如果 FRET 不变的话，发射强度应保持为常数。为减少光漂白，减少曝光时间和激发光强。以 “ Binning” 方式读取 CCD 照片数据时，会将许多点的数据相加，所以在维持高信噪比的同时，只需较少的光。
参考文献
1. Takahashi, A. , Camacho, P. , Lechleiter, J. D. , and Herman, B. ( 1 9 9 9 ) Measurement of intracellular Ca2+.Physiol. Rev. 79 9 1 089-1125 .
2. Miyawaki, A. and Tsien, R. Y. (2000) Monitoring protein conformations and interactions by fluorescence reso-nance energy transfer between mutants of green fluorescent protein. Methods EnzymoL 327, 472-500.
3. Truong, K. and Ikura, M. (200 1 ) The use of FRET imaging microscopy to detect protein-protein interactions andprotein conformational changes in vivo . Curr. Opin. Struct. Biol, l i , 573-578.
4. Tsien, R. Y. (1998) The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biocherru 67, 509-544.
5. Truong, K. , Sawano, A. , Mizuno, H. , et al. (200 1 ) FRET-based in vivo Ca2+imaging by a new calmodulinGFP fusion molecule. Nat. Struct. Biol.8, 1069-1 073.
6. Miyawaki, A. , Llopis, J. , Heim, R. , et al. ( 1 997) Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescentproteins and calmodulin. Nature 388, 882-887.
7. Miyawaki, A. , Griesbeck, O. , Heim, R. , and Tsien, R. Y. ( 1 999) Dynamic and quantitative Ca2+ measure-ments using improved chameleons. Proc. Natl. Acad. Sci- USA 9 6 , 2 135-2 140.
8. Sambrook, J. , Fritsch, E. F. , and Maniatis, T. ( 1 989) Molecular Cloning ^ A Laboratory Manual.2nd e d .,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
9. Tsien, R. and Pozzan, T. ( 1 9 8 9 ) Measurement of cytosolic free Ca2+ with quin2. Methods EnzymoL 112,230-262.
10. Bootman, M. D. , Cheek, T. R. , Moreton, R. B. , Bennett, D. L. , and Berridge, M. J. (1 99 4 ) Smoothly gradedCa2+ release from inositol 1 , 4 , 5-trisphosphate-sensitive Ca2+ stores. BioZ. C/iem. 2 6 9 ， 24783-2 4791.
11. Zamani, M. R. and Bristow, D. R. ( 1 99 6 ) The histamine HI receptor in GT 1-7 neuronal cells is regulated byCa2+ influx and KN-62, a putative inhibitor of Ca2+/calmodulin protein kinase ll. Br. J . PharynacoL 118,111 9-11 2 6 .
12. Mizuno, H. , Sawano, A. , Eli, P. , Hama, H. , andMiyawaki, A. (200 1 ) Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy transfer. Biochemistry 4 0, 2502-2510.
13. Matz, M. V. , Fradkov, A. F. , Labas, Y. A. , et al. ( 1 999) Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nat. BiotechnoL 1 7, 969-973.
Ca2+ 浓度（[ Ca2+ ] ) 变化涉及细胞过程，如细胞发育、分化和凋亡，在它们存在的时空环境中研究这些变化，可以深入地了解它们的生物学意义。合成染料（ 如 Fura 和 Indo) 和发光蛋白（aequorin) 是研究 [Ca2+] 变化的常用工具，但是，多数合成染料迅速从细胞中流失，发光蛋白只有微弱的生物光且不能按比例显示[Ca2+] 的变化[ 1 ] 。相反，蛋白质 Ca2+ 传感器基于 Ca2+- 钙调素复合物和绿色荧光蛋白（起先被命名为钙变色子）克服了原先的这两个限制 （ 见注 1 )。本章我们描述包括钙变色子克隆、生化特性的鉴定和用数字荧光显微镜在单个细胞中成像的有关方法。在我们能够描述这些方法之前，必须理解荧光共振能量转移理论（ FRET ; 见 4.1.1 ) 和对钙变色子的一般设计（见 4.1.2)。
1.1 FRET ( 荧光共振能量转移）的概念
FRET 是能量从给体荧光团到受体荧光团的转移。如果给体的发射谱与受体的激发谱严重重叠，这种转移就能够发生。这种能量转移在距离小于 80 A 时发生，并当两个荧光团靠得最近且取向平行时效率最高 [2，3] 。在设计钙变色子时，用 GFP 突变体作为两个伙伴荧光团：蓝绿色荧光蛋白作为给体，而黄色荧光蛋白作为受体（见图4.1 ; 参考文献 [4])。如果两个荧光团融合于不同的作用伙伴，分子间 FRET 可以用来探测蛋白质-蛋白质相互作用，而如果两个荧光团都融合到同一个蛋白质，分子内 FRET 可用来探测蛋白质剪切和构象变化 [3] 。
4.1.2 钙变色子的一般设计
使用分子内 FRET 的概念，钙变色子由夹在 CFP 和 YFP 之间的，前后融合的 CaM 的 N 端和 C 端结构域（分别记为 N-CaM 和 C-CaM ) 以及 CaM 识别序列（CRS) 组成 [5~7] 。CRS 的位置取决于它的结合取向，它或者放在 CaM 的 N 端、CaM 的 C 端，或者放在 N-CaM 和 C-CaM 之间 [ 见图 4.2 ( A ) 和注 2] 。在 Ca2+ 流入之后，CaM 结合到 CRS 上，引起构象变化，拉近 CFP 和 YFP，以增加 FRET 效率（见图4.2B)。已用 CFP-YFP 作 FRET 伙伴，制造出数种黄色的钙变色子（YC ) ，它们具有不同的 Ca2+ 亲和力、亚细胞定位和动态范围。本章提供的方法适用于所有已发表的用于 Ca2+ 成像的 YC，包括 YC2.1，它基于 CaM 结合到肌球蛋白轻链激酶 CRS 肽上的结构 ( MLCKp；参考文献 [7])；YC3.1，CaM 的单点突变 E104Q 降低了 Ca2+ 亲和力 [7]； YC2nu，以核为目标；YC6.1，基于改善了动态范围的，CaM 结合于 CaM 依赖激酶的激酶 CRS 肽（CKKp) 的结构。
2. 材料
2.1 钙变色子的克隆
( 1 ) PRSETB 细菌表达质粒（Invitrogen ) : 用于 Ni-次氮基三乙酸（NTA ) 琼脂糖蛋白纯化的 His-tag；用于选择的氨苄青霉素和用于诱导蛋白质表达的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG )。
( 2 ) pcDNA3 哺乳动物瞬时表达质粒（Invitrogen ) : 巨细胞病毒启动子和用于细菌选择的氨苄青霉素抗性基因。
2.2 生物化学和生物物理鉴定
( 1 ) Luria-Bertani ( LB ) 培养基：10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母提取液和 5 g 氯化钠；加入水至终体积 1 L。
( 2 ) IPTG。
( 3 ) 苯甲基横酰基氟化物。
( 4 ) Ni-NTA 琼脂糖（Qiagen)。
( 5 ) 大肠杆菌菌株 BL21 ( DE3 )。
( 6 ) 超声发生器。
( 7 ) EGTA 缓冲液：100 mmol/L 氯化钾，50 mmol/L pH 7.4 的 HEPES 和 10 mmol/L EGTA。
( 8 ) 氯化钙缓冲液：100 mmol/L 氯化钾，50 mmol/L pH 7.4 的 HEPES，10 mmol/L EGTA；和 10 mmol/L 氯化钙。
( 9 ) 荧光光谱仪（Shimadzu)。
2.3 钙变色子的成像
( 1 ) 含 10% 胎牛血清（FBS) 的 Dulbecco 的修饰 Eagle 培养液（DMEM )。
( 2 ) 含 Ca2+ 的 Hank's 平衡盐溶液（Gibco)。
( 3 ) 37°C 二氧化碳培养箱。
( 4 ) HeLa 细胞株。
( 5 ) Genejuice (Novagen)。
( 6 ) 奥林巴斯 IX70 倒置表面荧光显微镜。
( 7 ) 奥林巴斯氙灯。
( 8 ) MicroMax 1300YHS 电荷耦合器件（CCD) 照相机和 Metafluor 4.5r2 软件控制的 Sutter Lambda 10-2 滤镜转换器。
( 9 ) CFP- YFPFRET 滤镜组（Omega Optical ; 见注 3 ): 440AF21 激发滤镜（CFP 激发），455DRLP 二色镜，480AF30 发射滤镜（CFP 发射）和 535AF26 发射滤镜 ( YFP 发射)。
( 10 ) 中性密度滤镜（ND) 组（Omega Optical)。 .
( 11 ) UApo X 40 油 Iris/340 物镜（奥林巴斯）。
( 12 ) U-MNIBA 带通直角镜单元（奥林巴斯）。
( 13 ) 组胺，离子霉素，EGTA 和 BAPTA-AM (Sigma)。
( 14 ) 35 mm 直径玻璃底皿（Maltek)。
4. 注
1. 钙变色子不是没有它们自身的局限。通常，它们比提到的其他方法有较低的信噪比。但是，正如文中所述，信噪比可通过仔细设计新的建构 [5 ] 或通过优化实验条件来改善。
2. 插入 CRS 的最好的地方，依赖于三维结构中，两个 CaM 结构域相对于 CRS 的排布。如果在 CaM-CRS 复合物中，CRS 的 N 端在 CaM 的 C 端的 20A 之内，CaMCRS 融合就是有效的 [6] 。但是，如果 N 端和 C 端都在 CaM 铰链的 10A 之内，（NCaM) -CRS- ( C-CaM) 融合会是最有效的。
3. 如果在自己的应用中只对使用 CFP 和 YFP 感兴趣，CFP-YFP FRET 滤光组合会满足你的需求。如果你想在FRET 中使用 Discosom 红色荧光蛋白 CdsRed；参考文献 [ 12 ] 和 [13])，需要下列来自 Omega Optical 的或类似的双色镜和滤光镜：双色镜 450-520-590 TBDR 用于二色镜；440DF21 用于 CFP 激发；510DF23 用于 YFP激发；575DF26 用于 dsRed 激发。480AF30 用于 CFP 发射；535AF 26 用于 YFP 发射；600ALP 用于 dsRed发射。这一滤镜组允许你激发和接收单独来自 CFP、YFP 和 dsRed 的光，但效率会有降低。
4. 在钙变色子的建构中，我们切除了 CFP 的 C 端 11 个氨基酸（形成 GFP 极小域），以减少荧光团的相对翻滚。甚至，把氨基乙酸-甘氨酸连接引入 CaM 和 CRS 融合蛋白中，以增加 Ca2+ CaM-CRS 复合物的构象自由度。
5. 在为插入 PRSETB 或 pcDNA3 而用聚合酶链反应扩增钙变色子 DNA 时，记住钙变色子的 5' 和 3' 引物会有内引物位点，因为，CFP 和 YFP 只有几个点突变的差别。需从琼脂糖胶上纯化大小正确的 DNA 片段。
6. 如果你的实验中钙变色子降解或在细菌细胞中不溶，可以用哺乳细胞降解物完成鉴定。为收获产物，细胞应生长在直径为 10 cm 的培养皿中。转染 24 h 后，把细胞刮出培养皿并在低渗的破解缓冲液（50 mmol/L HEPES，pH 7.4 和 100 mmol/L 氯化钾；5 mmol/L 氯化镁和 0.5% Triton X-100 ) 中破碎。然后离心混合物以去除碎片。下一步，在 2 L 缓冲液（50 mmol/L HEPES，pH 7.4 和 100 mmol/L 氯化钾）中透析上清液。最后，样品可用于鉴定，如 4.3.2.2 和 4.3.2.3 节所述。
7. Ca2+ 结合曲线的精度取决于 Ca2+/EGTA 缓冲液的精确配制 [9]。
8. 由于光漂白作用，实验过程中发射强度会增加；但是，如果 FRET 不变的话，发射强度应保持为常数。为减少光漂白，减少曝光时间和激发光强。以 “ Binning” 方式读取 CCD 照片数据时，会将许多点的数据相加，所以在维持高信噪比的同时，只需较少的光。
参考文献
1. Takahashi, A. , Camacho, P. , Lechleiter, J. D. , and Herman, B. ( 1 9 9 9 ) Measurement of intracellular Ca2+.Physiol. Rev. 79 9 1 089-1125 .
2. Miyawaki, A. and Tsien, R. Y. (2000) Monitoring protein conformations and interactions by fluorescence reso-nance energy transfer between mutants of green fluorescent protein. Methods EnzymoL 327, 472-500.
3. Truong, K. and Ikura, M. (200 1 ) The use of FRET imaging microscopy to detect protein-protein interactions andprotein conformational changes in vivo . Curr. Opin. Struct. Biol, l i , 573-578.
4. Tsien, R. Y. (1998) The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biocherru 67, 509-544.
5. Truong, K. , Sawano, A. , Mizuno, H. , et al. (200 1 ) FRET-based in vivo Ca2+imaging by a new calmodulinGFP fusion molecule. Nat. Struct. Biol.8, 1069-1 073.
6. Miyawaki, A. , Llopis, J. , Heim, R. , et al. ( 1 997) Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescentproteins and calmodulin. Nature 388, 882-887.
7. Miyawaki, A. , Griesbeck, O. , Heim, R. , and Tsien, R. Y. ( 1 999) Dynamic and quantitative Ca2+ measure-ments using improved chameleons. Proc. Natl. Acad. Sci- USA 9 6 , 2 135-2 140.
8. Sambrook, J. , Fritsch, E. F. , and Maniatis, T. ( 1 989) Molecular Cloning ^ A Laboratory Manual.2nd e d .,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
9. Tsien, R. and Pozzan, T. ( 1 9 8 9 ) Measurement of cytosolic free Ca2+ with quin2. Methods EnzymoL 112,230-262.
10. Bootman, M. D. , Cheek, T. R. , Moreton, R. B. , Bennett, D. L. , and Berridge, M. J. (1 99 4 ) Smoothly gradedCa2+ release from inositol 1 , 4 , 5-trisphosphate-sensitive Ca2+ stores. BioZ. C/iem. 2 6 9 ， 24783-2 4791.
11. Zamani, M. R. and Bristow, D. R. ( 1 99 6 ) The histamine HI receptor in GT 1-7 neuronal cells is regulated byCa2+ influx and KN-62, a putative inhibitor of Ca2+/calmodulin protein kinase ll. Br. J . PharynacoL 118,111 9-11 2 6 .
12. Mizuno, H. , Sawano, A. , Eli, P. , Hama, H. , andMiyawaki, A. (200 1 ) Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy transfer. Biochemistry 4 0, 2502-2510.
13. Matz, M. V. , Fradkov, A. F. , Labas, Y. A. , et al. ( 1 999) Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nat. BiotechnoL 1 7, 969-973.
