大肠杆菌中非天然氨基酸的整体掺入
丁香园
5845
1. 介绍
包含非天然氨基酸的蛋白质的过量表达已引起越来越多科学家的关注。作为一个例子，非天然氨基酸的定点掺入，使关于蛋白质结构和功能的化学假定的特异检测成为可能。类似地，具有新化学性质的非天然氨基酸的定点掺入，可能使蛋白质产生新的功能，如与酮基取代的氨基酸交联 [1] 。对整个蛋白质的整体非天然氨基酸掺入，也可能导 致新的物理或功能性质。例如，用硒代甲硫氨酸那样的重原子类似物代替甲硫氨酸，已成为 X 射线晶体学中得到差值图（进而得到位相，解析蛋白质晶体结构——译者注）的有用工具 [2] 。用非天然氨基酸整体地扰动生物体的蛋白质组，已被用来在实验中探测基因编码的进化。细菌和噬菌体已适应于非天然氨基酸的掺入，并且为这些进化转变所需要的突变的数量和类型也已经过检验 [ 3~6 ]。
虽然有大量文献涉及细菌在非天然氨基酸环境中的生长（如用色氨酸类似物，见参考文献 [ 7~11 ] )，但其中大部分只是叙述技术，而没有考虑工艺规程的改变怎样影响实验结果。为此，我们在这里提供一些更详尽的方法。
2. 材料
( 1 ) 大肠杆菌菌株 C600 和衍生菌株 C600p。用于转化的菌株。
( 2 ) Luria-Bartani 培养基（每升含：10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母抽提物、10 g 氯化钠和 1.5% 菌用琼脂糖用于培养板）和基本培养基 M9 ( 5X 原液，每升含：30 g 磷酸氢二钠、15 g 磷酸二氢钾、5 g 氯化铵、2.5 g 氯化钠和 1.5% 菌用琼脂糖用于培养板），补充以 20 μg/ml 氨基酸（见注 1 ) 和 0.0005% 硫胺。富培养基和基本培养基都如标示的那样补充以抗生素：50 μg/ml 氨苄青霉素（Ap) 或卡那霉素（Kn)。
( 3 ) 色氨酸类似物：4-、5- 和 6- 氟色氨酸（ fW )，Sigma ( St. Louis，MO)。
( 4 ) 质粒：用于蛋白质高表达。用于基因的聚合酶链反应（PCR ) 扩增或另外来源的编码 GFPuv 基因和质粒来源的 Kn 激酶基因。
( 5 ) Vent 和 Tag DNA 聚合酶，限制性内切核酸酶，DNA 酶，T4 激酶和 T4 DNA 连接酶。
( 6 ) 寡核苷酸引物和 dNTP. （Invitrogen)。
( 7 ) 细菌蛋白抽提物试剂（B-PER ) 和 B-PER II ( Pierce，Beverly，MA) 。
( 8 ) 100 mmol 溶于水的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG ) 作为储备液。
( 9 ) Microcon 浓缩器，拦截的相对分子质量为 10000。
( 10 ) 谷胱甘肽-琼脂糖糖球珠（Amersham Biosciences， Piscataway， NJ)。
( 11 ) Ni-次氮基三乙酸（NTA ) 树脂（Novagen) 和蛋白质纯化柱（Bio- Rad，Hercules，CA )。
( 12 ) Centri-Sep 尺寸排斥柱（Princeton Separation， Adelphia，NJ)。
( 13 ) L-甲苯磺酰氨-2-苯乙基氯甲基酮处理过的胰蛋白酶（Pierce，Beverly，MA)。
( 14 ) 磷酸缓冲液（PBS)：10X 储备液，每升含：80 g 氯化钠、2 g 氯化钾、11.5 g 磷酸氢二钠水合物（ Na2HPO4·7H2O ) 和 2 g 磷酸二氢钾。
( 15 ) 1 mol/L 氯化镁。
( 16 ) 50 mmol/L Tris-氯化氢，pH 8.0 和 5 mmol/L 还原谷胱甘肽。
( 17 ) Ni-NTA 纯化用的缓冲液：
a. 结合缓冲液，8X 储备液：160 mmol/L Tris-氯化氢，pH 7.9，4 mol/L 氯化钠和 40 mmol/L 咪唑。
b. 清洗缓冲液，8X 储备液：160 mmol/L Tris-氯化氢，pH 7.9，4 mol/L 氯化钠和 480 mmol/L 咪唑。
c. 洗脱缓冲液，8X 储备液：160 mmol/L Tris-氯化氢，pH 7.9，4 mol/L 氯化钠和 2 mol/L 咪唑。
( 18 ) 高效液相层析（HPLC) 分析用的缓冲液：
a. 缓冲液 A：50 mmol/L NH4OAc，pH 5.0。
b. 缓冲液 B：50 mmol/L NH4OAc，pH 5.0 和 50% MeOH。
c. 缓冲液 C：0.1 mol/L 磷酸二氢钠，pH 2.5。
d. 缓冲液 D：0.1 mol/L 磷酸二氢钠，pH 2.5 和 50% MeOH。
( 19 ) 琼脂糖 DNA 凝胶设备和十二烷基硫酸钠（SDS) 凝胶电泳（PAGE ) 设备。
( 20 ) HPLC、HPLC-电喷电离（ESI ) 和质谱设备。
( 21 ) 微板阅读器。
4. 注
1. 光学纯（对应体纯）的非天然氨基酸可能不易购得。如果是消旋混合物，应使用 20 μg/ml L-对应体。如果非天然氨基酸是消旋混合物且要与天然氨基酸混合的话，应加倍非天然氨基酸的用量。例如，95% 4fW 需要 38 μg/ml DL-4fW 加 1 μg/ml L-W。
2. 为了掺入非天然氨基酸，优先使用营养缺陷型菌株，但并不是对所有应用都是必需的。为了选择展现基因编 码模糊的菌株，Doring 等使用了对缬氨酸和半胱氨酸是原养型的菌株，并选择在缬氨酸编码处可能用半胱氨酸代替缬氨酸的变种；结果是一个编码缺陷的异戊氨酰转移 RNA 合成酶 [19] 。
3. 此处讨论的是典型表达质粒的载体。一个是使用 T7 RNA 聚合酶系统并在 lac 操纵子的控制之下；而另一个是为了表达目标基因则直接使用 lac 启动子。许多其他的表达载体已被用于把非天然氨基酸掺入感兴趣的蛋白质中，并用于完整的、部分的和定点的类似物掺入[ 1，5，19] 。
4. 为了达到最大的表达和感兴趣的基因的掺入可能需要优化。优化的关键因素包括接种和转移到含引导物和非天然氨基酸的培养基之间的时机，以及表达延续时间的长短。例如，发现中指数期的培养液过夜表达的 GST 达到极大，而从中指数期再延续几小时的表达对 GFPuv 是最好的。更引人注目的是，用于荧光试剂的强蓝绿荧光蛋白的表达，包括荧光激活细胞分选，诱导过夜培养液再表达 6 h 的蛋白质最好。
5. 在这些例子中，用 HPLC 对水解蛋白的分析，通过检查产物中的天然的吸收光色氨酸得到简化。如果对其他氨基酸类似物完成类似的实验，氨基酸在 HPLC 分析之前可能需要衍生化。
6. 在 0.45 μm 孔径的 Millipore 旋转柱中完成实验，对胰蛋白酶处理更有效（M .P. Robertson，私人通信，2003 年 5 月 12 日）。在反应的最后时间，胰蛋白酶可以用离心来纯化。固定化的胰蛋白酶吸附在膜中，洗脱液携带反应产物。
参考文献
1. W a n g , L. , Z h a n g , Z. , B r o c k , A . , an d S c h u ltz , P. G. ( 2 0 0 3 ) A d d itio n o f th e k e to f u n ctio n al g r o u p to th e g en eticcode o f Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1 0 0 , 56-61 .
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4. B a c h e r, J. M. , B u ll, J. J . , a n d E llin g to n , A . D. ( 2 0 0 3 ) E v o lu tio n of p h ag e w ith ch em ically am b ig u o u s p r o -teo m es. BMC Evolutionary Biol. 3 , 24.
5. Bacher, J. M. and E llin g to n , A. D. (2 0 0 1 ) Selection and characterization of Escherichia coli variants capable of g ro w th onan otherw ise toxic try p to p h an analogue. J. BacterioL 1 8 3 , 5414-5425.
6. W o n g , J . T . ( 1 9 8 3 ) M e m b e rs h ip m u ta tio n o f th e g en etic co d e ： lo ss o f f itn e ss b y tr y p to p h a n . Proc,Natl. Acad. Sci. USA 8 0 , 6303 -6 3 0 6 .
7. B r o n sk ill, P . M. an d W o n g , J. T . ( 1 9 8 8 ) S u p p re ss io n o f flu o rescen ce o f tr y p to p h a n resid u es in p r o te in s b y r ep lacem en t w ith 4 - f lu o r o tr y p to p h a n . Biochem, J . 2 4 9 , 305-308.
8. P arso n s, J. F. , X iao, G. , Gilliland, G. L. , and A rm stro n g , R N. ( 1 9 9 8 ) Enzymes harboring u n n atu ral amino acid s： m echanistic and stru ctu ral analysis of th e enhanced catalytic activity of a glu tath io n e tran sferase containing 5_fluorotrypto_phan. Biochemistry 3 7 , 6286-6294.
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13. X u , Z. J. , L o v e, M . L. , M a , L. Y. , e t al. ( 1 9 8 9 ) T r y p to p h a n y l- tR N A s y n th e ta s e fro m Bacillus subtilis. C h a racter izatio n an d ro le of h y d r o p h o b icity in s u b s tr a te reco g n itio n . J . Biol. Chem. 2 6 4 , 430 4 -4 3 1 1 .
14. H e n d r ic k s o n , T . L. , N o m a n b h o y , T . K. , de C r ecy - L a g ard , V. , e t al. ( 2 0 0 2 ) M u ta tio n a l s e p a ra tio n o f tw op a th w a y s f o r ed itin g b y a class I tR N A s y n th e ta s e . Mol. Cell. 9 , 35 3 -3 6 2 .
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20. W a n g , L. , B r o ck , A. , H e r b e r ic h , B. , an d S c h u ltz , P. G. ( 2 0 0 1 ) E x p an d in g th e g en etic code o f Escherichia coli. Science 2 9 2 , 4 9 8 -5 0 0
包含非天然氨基酸的蛋白质的过量表达已引起越来越多科学家的关注。作为一个例子，非天然氨基酸的定点掺入，使关于蛋白质结构和功能的化学假定的特异检测成为可能。类似地，具有新化学性质的非天然氨基酸的定点掺入，可能使蛋白质产生新的功能，如与酮基取代的氨基酸交联 [1] 。对整个蛋白质的整体非天然氨基酸掺入，也可能导 致新的物理或功能性质。例如，用硒代甲硫氨酸那样的重原子类似物代替甲硫氨酸，已成为 X 射线晶体学中得到差值图（进而得到位相，解析蛋白质晶体结构——译者注）的有用工具 [2] 。用非天然氨基酸整体地扰动生物体的蛋白质组，已被用来在实验中探测基因编码的进化。细菌和噬菌体已适应于非天然氨基酸的掺入，并且为这些进化转变所需要的突变的数量和类型也已经过检验 [ 3~6 ]。
虽然有大量文献涉及细菌在非天然氨基酸环境中的生长（如用色氨酸类似物，见参考文献 [ 7~11 ] )，但其中大部分只是叙述技术，而没有考虑工艺规程的改变怎样影响实验结果。为此，我们在这里提供一些更详尽的方法。
2. 材料
( 1 ) 大肠杆菌菌株 C600 和衍生菌株 C600p。用于转化的菌株。
( 2 ) Luria-Bartani 培养基（每升含：10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母抽提物、10 g 氯化钠和 1.5% 菌用琼脂糖用于培养板）和基本培养基 M9 ( 5X 原液，每升含：30 g 磷酸氢二钠、15 g 磷酸二氢钾、5 g 氯化铵、2.5 g 氯化钠和 1.5% 菌用琼脂糖用于培养板），补充以 20 μg/ml 氨基酸（见注 1 ) 和 0.0005% 硫胺。富培养基和基本培养基都如标示的那样补充以抗生素：50 μg/ml 氨苄青霉素（Ap) 或卡那霉素（Kn)。
( 3 ) 色氨酸类似物：4-、5- 和 6- 氟色氨酸（ fW )，Sigma ( St. Louis，MO)。
( 4 ) 质粒：用于蛋白质高表达。用于基因的聚合酶链反应（PCR ) 扩增或另外来源的编码 GFPuv 基因和质粒来源的 Kn 激酶基因。
( 5 ) Vent 和 Tag DNA 聚合酶，限制性内切核酸酶，DNA 酶，T4 激酶和 T4 DNA 连接酶。
( 6 ) 寡核苷酸引物和 dNTP. （Invitrogen)。
( 7 ) 细菌蛋白抽提物试剂（B-PER ) 和 B-PER II ( Pierce，Beverly，MA) 。
( 8 ) 100 mmol 溶于水的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG ) 作为储备液。
( 9 ) Microcon 浓缩器，拦截的相对分子质量为 10000。
( 10 ) 谷胱甘肽-琼脂糖糖球珠（Amersham Biosciences， Piscataway， NJ)。
( 11 ) Ni-次氮基三乙酸（NTA ) 树脂（Novagen) 和蛋白质纯化柱（Bio- Rad，Hercules，CA )。
( 12 ) Centri-Sep 尺寸排斥柱（Princeton Separation， Adelphia，NJ)。
( 13 ) L-甲苯磺酰氨-2-苯乙基氯甲基酮处理过的胰蛋白酶（Pierce，Beverly，MA)。
( 14 ) 磷酸缓冲液（PBS)：10X 储备液，每升含：80 g 氯化钠、2 g 氯化钾、11.5 g 磷酸氢二钠水合物（ Na2HPO4·7H2O ) 和 2 g 磷酸二氢钾。
( 15 ) 1 mol/L 氯化镁。
( 16 ) 50 mmol/L Tris-氯化氢，pH 8.0 和 5 mmol/L 还原谷胱甘肽。
( 17 ) Ni-NTA 纯化用的缓冲液：
a. 结合缓冲液，8X 储备液：160 mmol/L Tris-氯化氢，pH 7.9，4 mol/L 氯化钠和 40 mmol/L 咪唑。
b. 清洗缓冲液，8X 储备液：160 mmol/L Tris-氯化氢，pH 7.9，4 mol/L 氯化钠和 480 mmol/L 咪唑。
c. 洗脱缓冲液，8X 储备液：160 mmol/L Tris-氯化氢，pH 7.9，4 mol/L 氯化钠和 2 mol/L 咪唑。
( 18 ) 高效液相层析（HPLC) 分析用的缓冲液：
a. 缓冲液 A：50 mmol/L NH4OAc，pH 5.0。
b. 缓冲液 B：50 mmol/L NH4OAc，pH 5.0 和 50% MeOH。
c. 缓冲液 C：0.1 mol/L 磷酸二氢钠，pH 2.5。
d. 缓冲液 D：0.1 mol/L 磷酸二氢钠，pH 2.5 和 50% MeOH。
( 19 ) 琼脂糖 DNA 凝胶设备和十二烷基硫酸钠（SDS) 凝胶电泳（PAGE ) 设备。
( 20 ) HPLC、HPLC-电喷电离（ESI ) 和质谱设备。
( 21 ) 微板阅读器。
4. 注
1. 光学纯（对应体纯）的非天然氨基酸可能不易购得。如果是消旋混合物，应使用 20 μg/ml L-对应体。如果非天然氨基酸是消旋混合物且要与天然氨基酸混合的话，应加倍非天然氨基酸的用量。例如，95% 4fW 需要 38 μg/ml DL-4fW 加 1 μg/ml L-W。
2. 为了掺入非天然氨基酸，优先使用营养缺陷型菌株，但并不是对所有应用都是必需的。为了选择展现基因编 码模糊的菌株，Doring 等使用了对缬氨酸和半胱氨酸是原养型的菌株，并选择在缬氨酸编码处可能用半胱氨酸代替缬氨酸的变种；结果是一个编码缺陷的异戊氨酰转移 RNA 合成酶 [19] 。
3. 此处讨论的是典型表达质粒的载体。一个是使用 T7 RNA 聚合酶系统并在 lac 操纵子的控制之下；而另一个是为了表达目标基因则直接使用 lac 启动子。许多其他的表达载体已被用于把非天然氨基酸掺入感兴趣的蛋白质中，并用于完整的、部分的和定点的类似物掺入[ 1，5，19] 。
4. 为了达到最大的表达和感兴趣的基因的掺入可能需要优化。优化的关键因素包括接种和转移到含引导物和非天然氨基酸的培养基之间的时机，以及表达延续时间的长短。例如，发现中指数期的培养液过夜表达的 GST 达到极大，而从中指数期再延续几小时的表达对 GFPuv 是最好的。更引人注目的是，用于荧光试剂的强蓝绿荧光蛋白的表达，包括荧光激活细胞分选，诱导过夜培养液再表达 6 h 的蛋白质最好。
5. 在这些例子中，用 HPLC 对水解蛋白的分析，通过检查产物中的天然的吸收光色氨酸得到简化。如果对其他氨基酸类似物完成类似的实验，氨基酸在 HPLC 分析之前可能需要衍生化。
6. 在 0.45 μm 孔径的 Millipore 旋转柱中完成实验，对胰蛋白酶处理更有效（M .P. Robertson，私人通信，2003 年 5 月 12 日）。在反应的最后时间，胰蛋白酶可以用离心来纯化。固定化的胰蛋白酶吸附在膜中，洗脱液携带反应产物。
参考文献
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