根分生细胞核蛋白质提取
丁香园
1716
1. 前言
用蛋白质组学鉴别植物蛋白质经常遇到植物基因组序列数据量不够的问题。只有拟南芥和水稻被全部测序,这就意味着只有极少情况下可以专门使用质谱分析法(MS) 鉴别蛋白质,通常是用拟南芥这种模式植物 [ 1,2] 。在其他情况下,MS 测序可以同时用 Edman 测序 [ 3,4] 来测定氨基酸末端序列。另一种方法是在用光谱分析法测得末端序列后鉴别蛋白质,然后和已知序列的基因比对 [ 1,3,5,6] 。总的来说,用已知基因组序列的模式植物研究极大推进了植物蛋白质组学。
我们这里描述的这种方法适用于未知基因序列的植物。集中研究少数蛋白质,这些蛋白质存在于已知功能的不同馏分中。因此,我们研究亚细胞结构的蛋白质组学,即细胞核研究,并且将它分为亚蛋白质组进行研究。
很明显,第一步是获取生物材料以用来研究。因为我们感兴趣于研究核蛋白相关的细胞增殖,所以我们选择根尖分生组织细胞群。材料是匀浆后纯化细胞器(此处为细胞核)。从分生组织细胞中分离细胞核比较容易,因为这类细胞核占据很大体积。
从这些被纯化的细胞核中,通过逐渐增加缓冲液离子强度而逐渐增大蛋白溶解度,依次得到的蛋白质组分,最后得到一系列的亚蛋白质组 [8] 。首先得到漂洗组分包含核膜和残留细胞骨架的蛋白质。随后得到的镏分可溶解在含有 EDTA 的低离子强度缓冲液中,此溶液被称为 S2 , 从这里我们得到溶解性最好的核蛋白质,即核糖核蛋白。第三步,在用糖核酸酶反应后,我们会提取到染色质蛋白质。最后的两份馏分中含有细胞核基质蛋白质,先溶解在高盐缓冲液中,然后得到不溶的沉淀。这些不溶性沉淀和含有 RNA 的微丝网有关系 [ 10] 。
在提取一系列的蛋白质之后,每份馏分都在适合的缓冲液里溶解,以便于单向电泳或双向凝胶分离蛋白质。事实上,双向凝胶可以用于各种处理情况下的细胞蛋白质表达情况比较,如不同生理状态细胞,或某种的突变体或转基因植株,或药物处理,或受到不同刺激物刺激。特别是我们已经使用这种方法鉴定细胞增殖过程中的核蛋白质 [ 11] ,以及测定在国际空间站中由微重力而引起的表达变化 [ 12] 。
用蛋白质组学鉴别植物蛋白质经常遇到植物基因组序列数据量不够的问题。只有拟南芥和水稻被全部测序,这就意味着只有极少情况下可以专门使用质谱分析法(MS) 鉴别蛋白质,通常是用拟南芥这种模式植物 [ 1,2] 。在其他情况下,MS 测序可以同时用 Edman 测序 [ 3,4] 来测定氨基酸末端序列。另一种方法是在用光谱分析法测得末端序列后鉴别蛋白质,然后和已知序列的基因比对 [ 1,3,5,6] 。总的来说,用已知基因组序列的模式植物研究极大推进了植物蛋白质组学。
我们这里描述的这种方法适用于未知基因序列的植物。集中研究少数蛋白质,这些蛋白质存在于已知功能的不同馏分中。因此,我们研究亚细胞结构的蛋白质组学,即细胞核研究,并且将它分为亚蛋白质组进行研究。
很明显,第一步是获取生物材料以用来研究。因为我们感兴趣于研究核蛋白相关的细胞增殖,所以我们选择根尖分生组织细胞群。材料是匀浆后纯化细胞器(此处为细胞核)。从分生组织细胞中分离细胞核比较容易,因为这类细胞核占据很大体积。
从这些被纯化的细胞核中,通过逐渐增加缓冲液离子强度而逐渐增大蛋白溶解度,依次得到的蛋白质组分,最后得到一系列的亚蛋白质组 [8] 。首先得到漂洗组分包含核膜和残留细胞骨架的蛋白质。随后得到的镏分可溶解在含有 EDTA 的低离子强度缓冲液中,此溶液被称为 S2 , 从这里我们得到溶解性最好的核蛋白质,即核糖核蛋白。第三步,在用糖核酸酶反应后,我们会提取到染色质蛋白质。最后的两份馏分中含有细胞核基质蛋白质,先溶解在高盐缓冲液中,然后得到不溶的沉淀。这些不溶性沉淀和含有 RNA 的微丝网有关系 [ 10] 。
在提取一系列的蛋白质之后,每份馏分都在适合的缓冲液里溶解,以便于单向电泳或双向凝胶分离蛋白质。事实上,双向凝胶可以用于各种处理情况下的细胞蛋白质表达情况比较,如不同生理状态细胞,或某种的突变体或转基因植株,或药物处理,或受到不同刺激物刺激。特别是我们已经使用这种方法鉴定细胞增殖过程中的核蛋白质 [ 11] ,以及测定在国际空间站中由微重力而引起的表达变化 [ 12] 。