木本植物蛋白质提取
丁香园
2082
1. 前目
在多年生植物中，维管形成层产生次生木质部组织而形成了一种独特组织，称为木材 [1] 。木材由疏导分子和非疏导分子组成，用于水和营养物质在树木中的长距离运输 ( 参见 Ecotree 站点可获得更多信息 http://www. botany, uwc. ac. za/ecotree/) 。在裸子植物中，木材主要由两部分组成：管胞和木射线薄壁细胞。在被子植物中，木材同样包含维管束和纤维。这也是一种高度可变的材料。维管形成层的活动和新分裂细胞的分化通常受到环境和个体发育的影响，并最终影响木材特性。
木材在生物圈中贮存大气中过多的 CO2，在我们日常生活中是众多产品的原材料，也是一种用之不尽的可再生资源。可是关于木材形成过程知之甚少。木材形成是一种复杂的现象，由很多基因协同控制，特别是关于多糖、木质素和细胞壁蛋白生物合成和装配的一些基因[2] 。到目前为止，对于木材形成方面的分子机制研究主要通过转录组方法进行，结合 EST 测序以及转录组数据 [3~6] 。关于这方面的大规模转录组研究只有一项：从分化的海岸松的次生木质部组织中鉴定蛋白质 [7] 。
本章描述从 3 种森林树种木材形成组织中成功提取蛋白质的方法，即松树、白杨和橡树。这种方法也被成功应用于其他器官上，即根、叶、花粉、芽、花、形成层和韧皮部。双向电泳凝胶的结果可参见：http://cbi.kbri.fr /outils/protic/index. php。
2. 材料
2.1 组织的采样和贮存
1. 木材形成组织
( 1 ) 首先用 30 cm 刀片的刮树皮器切割下外表粗糙的树皮。
( 2 ) 用锋利的小刀在暴露的组织上切出一个切口（横两刀、竖两刀），剥离韧皮部和形成层。
( 3 ) 用蔬菜剥皮器或小刀从被剥离的原木表面采集正在分化的木质部（木材形成组织），并立即在液氮中冷冻。-80°C 保存用于蛋白质提取。
( 4 ) 样品要从生长季节生长的成年树木上采集（图 5-1)。不同形式的木材（早材和晚材、幼龄材和成材、对应区和应压区木材)[1] 化学成分、解剖学结构和物理特性不同，可从同一株提取。
2. 其他组织
为了获得植株不同组织或器官的蛋白质组表达图谱，以白杨为例进行说明，详见 http://cbi. labri. fr/outils/protic/PublicPopulus. php。需要从处于活跃生长期的幼苗或树木中采集叶、根、叶芽和花芽、花粉、韧皮部和形成层。
2.2 沉淀总蛋白质（见注释 1)
( 1 ) 聚碳酸酯 10 ml 橡胶边缘旋盖圆底高速离心管（nalgene，rochester，NY ) 。
( 2 ) 沉淀缓冲液（需要保存在 -20°C 的新鲜溶液）：含有 10% TCA 的溶液会让蛋白质有效地沉淀下来，并准备 0.07% β-巯基乙醇丙酮溶液。
( 3 ) 漂洗缓冲液（需要保存在 -20°C 的新鲜溶液）：0.07% β-巯基乙醇丙酮溶液。
2.3 蛋白质溶解（注释 2)
溶解缓冲液：7 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、0.4% TritonX -100 ( 见注释 3) 、4% CHAPS、10 mmol/L DTT、1% IPG 缓冲液（Amersham Bioscience，Uppsala，Sweden) ( 见注释 4) 。保存在 -20°C。
4. 注释
( 1 ) 注意：因为这种提取缓冲液中含有毒成分，并有刺激性的气味，因此应该在通风橱中进行制备。
( 2 ) 尿素和硫脲的溶解约需 30 min。绝对禁止用加热的方法促进缓冲液溶解。可以用超纯水（18.2 MΩ cm 电阻率）配制缓冲液。
( 3 ) 应先配制 20% Triton X-100 溶液，保存在 4°C 备用。
( 4 ) 根据等电聚焦步骤中选择的 IPG 胶条的 pH 梯度，选择合适的 IPG 缓冲液。
( 5 ) 虽然此方案只有一次重复取样，但通常每个样品能够提取 3 次蛋白质，所有提取蛋白量能够进行 5 次双向电泳。
( 6 ) 在离心之前离心机温度降到 0°C。
参考文献
1. Lachaud, S., Catesson, A. M., and Bonnemain, J. L. (1999) Structure and functionsof the vascular cambium C. R. A ca d . S ci. P a r is 322, 633-650.
2. Plomion, C., Le Provost, G., and Stokes, A. (2001) Wood formation in trees. P la n tP h ys io l. 127, 1513-1523.
3. Allona, I., Quinn, M., Shoop, I., et al. (1998) Analysis of xylem formation in pineby cDNA sequencing. P r o c. N a tl. A c a d . S ci. U SA 95, 9693-9698.
4. Sterky, F., Regan, S., Karlsson, J., et al. (1998) Gene discovery in wood formingtissues of poplar: Analysis of 5,692expressed sequence tags. P ro c. N a tl. A c a d . Sci.95, 13,330—13,335.
5. Hertzberg, M., Aspeborg, H., Schrader, J., et al. (2001) A Transcriptional roadmapto wood formation. P r o c. N a t. A c a d . U SA 98, 14,732-14,737.
6. Whetten, R., Sun, Y. H., Zhang, Y., and Sederoff, R. (2001) Functional genomicsand cell wall biosynhesis in loblolly pine. P la n t M o l. B io l. 47, 275-291.
7. Gion, J-M., Lalanne, C., Le Provost, G., et al. (2005) The proteome of maritimepine wood forming tissue. P r o te o m ic s 5, 3731-3751.
8 . Ramagli, L. S. and Rodriguez, L. V. (1985) Quantitation of microgram amounts ofprotein in two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis sample buffer. Electrophoresis 6, 559—563.
在多年生植物中，维管形成层产生次生木质部组织而形成了一种独特组织，称为木材 [1] 。木材由疏导分子和非疏导分子组成，用于水和营养物质在树木中的长距离运输 ( 参见 Ecotree 站点可获得更多信息 http://www. botany, uwc. ac. za/ecotree/) 。在裸子植物中，木材主要由两部分组成：管胞和木射线薄壁细胞。在被子植物中，木材同样包含维管束和纤维。这也是一种高度可变的材料。维管形成层的活动和新分裂细胞的分化通常受到环境和个体发育的影响，并最终影响木材特性。
木材在生物圈中贮存大气中过多的 CO2，在我们日常生活中是众多产品的原材料，也是一种用之不尽的可再生资源。可是关于木材形成过程知之甚少。木材形成是一种复杂的现象，由很多基因协同控制，特别是关于多糖、木质素和细胞壁蛋白生物合成和装配的一些基因[2] 。到目前为止，对于木材形成方面的分子机制研究主要通过转录组方法进行，结合 EST 测序以及转录组数据 [3~6] 。关于这方面的大规模转录组研究只有一项：从分化的海岸松的次生木质部组织中鉴定蛋白质 [7] 。
本章描述从 3 种森林树种木材形成组织中成功提取蛋白质的方法，即松树、白杨和橡树。这种方法也被成功应用于其他器官上，即根、叶、花粉、芽、花、形成层和韧皮部。双向电泳凝胶的结果可参见：http://cbi.kbri.fr /outils/protic/index. php。
2. 材料
2.1 组织的采样和贮存
1. 木材形成组织
( 1 ) 首先用 30 cm 刀片的刮树皮器切割下外表粗糙的树皮。
( 2 ) 用锋利的小刀在暴露的组织上切出一个切口（横两刀、竖两刀），剥离韧皮部和形成层。
( 3 ) 用蔬菜剥皮器或小刀从被剥离的原木表面采集正在分化的木质部（木材形成组织），并立即在液氮中冷冻。-80°C 保存用于蛋白质提取。
( 4 ) 样品要从生长季节生长的成年树木上采集（图 5-1)。不同形式的木材（早材和晚材、幼龄材和成材、对应区和应压区木材)[1] 化学成分、解剖学结构和物理特性不同，可从同一株提取。
2. 其他组织
为了获得植株不同组织或器官的蛋白质组表达图谱，以白杨为例进行说明，详见 http://cbi. labri. fr/outils/protic/PublicPopulus. php。需要从处于活跃生长期的幼苗或树木中采集叶、根、叶芽和花芽、花粉、韧皮部和形成层。
2.2 沉淀总蛋白质（见注释 1)
( 1 ) 聚碳酸酯 10 ml 橡胶边缘旋盖圆底高速离心管（nalgene，rochester，NY ) 。
( 2 ) 沉淀缓冲液（需要保存在 -20°C 的新鲜溶液）：含有 10% TCA 的溶液会让蛋白质有效地沉淀下来，并准备 0.07% β-巯基乙醇丙酮溶液。
( 3 ) 漂洗缓冲液（需要保存在 -20°C 的新鲜溶液）：0.07% β-巯基乙醇丙酮溶液。
2.3 蛋白质溶解（注释 2)
溶解缓冲液：7 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、0.4% TritonX -100 ( 见注释 3) 、4% CHAPS、10 mmol/L DTT、1% IPG 缓冲液（Amersham Bioscience，Uppsala，Sweden) ( 见注释 4) 。保存在 -20°C。
4. 注释
( 1 ) 注意：因为这种提取缓冲液中含有毒成分，并有刺激性的气味，因此应该在通风橱中进行制备。
( 2 ) 尿素和硫脲的溶解约需 30 min。绝对禁止用加热的方法促进缓冲液溶解。可以用超纯水（18.2 MΩ cm 电阻率）配制缓冲液。
( 3 ) 应先配制 20% Triton X-100 溶液，保存在 4°C 备用。
( 4 ) 根据等电聚焦步骤中选择的 IPG 胶条的 pH 梯度，选择合适的 IPG 缓冲液。
( 5 ) 虽然此方案只有一次重复取样，但通常每个样品能够提取 3 次蛋白质，所有提取蛋白量能够进行 5 次双向电泳。
( 6 ) 在离心之前离心机温度降到 0°C。
参考文献
1. Lachaud, S., Catesson, A. M., and Bonnemain, J. L. (1999) Structure and functionsof the vascular cambium C. R. A ca d . S ci. P a r is 322, 633-650.
2. Plomion, C., Le Provost, G., and Stokes, A. (2001) Wood formation in trees. P la n tP h ys io l. 127, 1513-1523.
3. Allona, I., Quinn, M., Shoop, I., et al. (1998) Analysis of xylem formation in pineby cDNA sequencing. P r o c. N a tl. A c a d . S ci. U SA 95, 9693-9698.
4. Sterky, F., Regan, S., Karlsson, J., et al. (1998) Gene discovery in wood formingtissues of poplar: Analysis of 5,692expressed sequence tags. P ro c. N a tl. A c a d . Sci.95, 13,330—13,335.
5. Hertzberg, M., Aspeborg, H., Schrader, J., et al. (2001) A Transcriptional roadmapto wood formation. P r o c. N a t. A c a d . U SA 98, 14,732-14,737.
6. Whetten, R., Sun, Y. H., Zhang, Y., and Sederoff, R. (2001) Functional genomicsand cell wall biosynhesis in loblolly pine. P la n t M o l. B io l. 47, 275-291.
7. Gion, J-M., Lalanne, C., Le Provost, G., et al. (2005) The proteome of maritimepine wood forming tissue. P r o te o m ic s 5, 3731-3751.
8 . Ramagli, L. S. and Rodriguez, L. V. (1985) Quantitation of microgram amounts ofprotein in two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis sample buffer. Electrophoresis 6, 559—563.
