木质部和韧皮部汁液蛋白质提取
丁香园
5427
1. 前言
高等植株的维管束可以运输营养物质，可使相距遥远的植物各部分之间进行交流。这些维管束包含两种运输单元，即木质部和韧皮部。木质部的主要功能是运输水及营养物质到达地上部分；韧皮部用于分配有机同化物，如糖和氨基酸，从生产源运输到植物体的其他部分。在不同植物的木质部和韧皮部的汁液中都发现了蛋白质。
尽管木质部细胞是死细胞，但在健康的和受病原体侵染的植物体中的木质部汁液仍含有低浓度的蛋白质，并且这些蛋白质具有特殊的功能，如用于维护、重建及强化细胞壁，或者用于防御病原体[ 1~5 ]。
构成韧皮部的运输管道称为筛管分子（SE ) 。筛管分子是高度特化的细胞，它没有细胞核和核糖体，因此筛管分子没有转录和翻译的功能。筛管中运输的液体一般被称为韧皮部汁液。在不同植物的韧皮部汁液里，已经发现了 100 多种蛋白质 [6] 。有一定数量的蛋白质已经被鉴别出来 [ 7~11] 。这些蛋白质可能是通过特殊的胞间连丝从紧密联系的伴胞（CC) 中运输过来 [12] 。相对于木质部汁液，韧皮部汁液中的蛋白质浓度达到了一个相当高的水平 （葫芦中高达 60 mg/ml ) [13] 。认为这种蛋白质在韧皮部的维护和防御上起到了一定作用，有些可能在长距离通信上起重要作用。
本章描述如何获得木质部和韧皮部汁液，并如何从中提取蛋白质用于蛋白质组学研究。
2. 材料
2.1 收集木质部汁液
( 1 ) 刀片。
( 2 ) 螺旋盖试管。
( 3 ) 用于收集木质部汁液的容器和冰。
2.2 浓缩木质部汁液蛋白质
( 1 ) 用 Amicon Centriprep YM -3 离心超滤浓缩器和（或）Amicon Centricon Plus-20 离心超滤管过滤装置过滤，并对木质部汁液蛋白质进行部分提纯。
( 2 ) 沉淀蛋白质，在 100% 丙酮中加入 12.5% TCA 并在使用前加入 β-苯巯基乙醇 ( 每 40 ml 含 35 μl β-苯巯基乙醇）或用 80% 丙酮沉淀。
2.3 收集韧皮部汁液
( 1 ) 消过毒的刀片或皮下注射针头。
( 2 ) 滤纸。
( 3 ) 用于收集韧皮部汁液的移液管、反应管和冰。
2.4 提纯韧皮部汁液蛋白
( 1 ) 2 mol/L HCl。
( 2 ) 2 mol/L NaOH ( 分析纯）。
( 3 ) 丙酮/甲醇/DTT [ 90% ( V/V）10% ( V/V）10 mmol/L ] ；100% 丙酮（分析纯 )。
4. 注释
( 1 ) 因为木质部汁液中含有蛋白酶，所以要注意样液必须时刻保持低温状态；可以使用蛋白酶抑制剂。
( 2 ) 番茄植株在汁液流出 6 h 后 ，汁液量会发生很大变化。从健康的、6~7 周大的一株植株中可以得到多于 10 ml 的汁液，但是偶尔从一株植株会取不到任何汁液或者很少量的汁液。植物生长的条件会明显影响汁液的获取量，不过我们还没有发现能够影响汁液获取量的特定条件究竟是什么。从染病的植物中只能得到较少量的汁液。如被维管萎蔫病真菌（尖孢镰刀菌）侵染了的植物。
( 3 ) 蛋白质或糖分的浓度可以被用于测量被韧皮部污染的程度；若木质部中两种物质浓度低，说明木质部汁液纯度高。
( 4 ) 多聚和寡聚糖可以和普通试剂反应来测量蛋白质浓度，像考马斯亮蓝和二喹啉甲酸（BCA，Sigma) 。它们在木质部汁液中会导致对蛋白质含量估算偏髙。
( 5 ) 活体植株中，筛管分子膨压为正，导管分子内膨压为负，所以只有韧皮部汁液可以从这种切口中获得。
( 6 ) 要牢记从切断的茎的有茎叶一侧取得韧皮部汁液，从另一侧（有根一侧）取得木质部汁液。
( 7 ) 因为韧皮部汁液通常含有髙浓度蛋白酶抑制剂，所以不需要加入化学蛋白酶抑制药剂。
( 8 ) 完成沉淀步骤后，检查蛋白质组成（如通过用 1- DE 分析蛋白质沉淀的组成）是很重要的。因为不单是 PP1 和 PP2，其他的蛋白质也会在这个过程中被沉淀。
( 9 ) 不要延长沉淀的时间，延长时间会使蛋白质变成不溶性的。
( 10 ) 用更高的速度离心会带来溶解问题。
( 11 ) 不要通过真空离心干燥，因为这会导致溶解性变差。
( 12 ) 如果沉淀不溶解，孵育更长时间，超声处理或在更高的温度下孵育也许会有效 。如果仍有不溶部分存在，在进行凝胶电泳之前离心样品。
参考文献
1. Rep, M., Dekker, H. L., Vossen, J. H., et al. (2003). A tomato xylem sap proteinrepresents a new family of small cysteine-rich proteins with structural similarity tolipid transfer proteins. F E B S L e tt.534, 82-86.
2 . Rep, M., Dekker, H. L., Vossen, J. H., et al.. (2002). Mass spectrometric identification of isoforms of PR proteins in xylem sap of fungus-infected tomato. P la n tP h y s io l. 1 30 , 904-917.
3. Sakuta, C. and Satoh, S. (2000). Vascular tissue-specific gene expression of xylemsap glycine-rich proteins in root and their localization in the walls of metaxylemvessels in cucumber. P la n t C e ll P h y s io l.41, 627-638.
4. Buhtz, A., Kolasa, A., Arlt, K., Walz, C., Kehr, J. (2004). Xylem sap protein composition is conserved among different plant species. P la n ta 219, 610-618.
5. Kehr, J., Buhtz, A. and Giavalisco, P. (2005). Analysis of xylem sap proteins fromB r a s s ic a n a p u s. B M C P la n t B io l.5, 11.
6. Fukuda, A., Okada, Y., Suzui, N., Fujiwara, T., Yoneyama, T., and Hayashi, H.(2004). Cloning and characterization of the gene for a phloem-specific glutathioneS-transferase from rice leaves. P h ysio l. P la n t. 120, 595-602.
7. Giavalisco, P., Kapitza, K., Kolasa, A., Buhtz, A., and Kehr, J. (2006). Towardsthe proteome of B r a s s ic a n a p u s phloem sap. P r o te o m ic s 6, 896— 909.
8 . Walz, C., Giavalisco, P., Schad, M., Juenger, M., Klose, J., and Kehr, J. (2004).Proteomics of curcurbit phloem exudate reveals a network of defence proteins.P h y to c h e m is tr y 6 5 , 1795-1804.
9 . Haebel, S. and Kehr, J. (2001). Matrix-assisted laser desorption/ionization time offlight mass spectrometry peptide mass fingerprints and post source decay: a toolfor the identification and analysis of phloem proteins from C u c u r b ita m a xim aDuch. separated by two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. P la n ta213, 586-593.
10 . Barnes, A., Bale, J., Constantinidou, C., Ashton, P., Jones, A., and Pritchard, J.(2004). Determining protein identity from sieve element sap in R ic in u s co m m u n isL. by quadrupole time of flight (Q-TOF) mass spectrometry. J. E xp . B o t. 55,1473-1481.
11. Hayashi, H., Fukuda, A., Suzui, N., and Fujimaki, S. (2000). Proteins in the sieveelement-companion cell complexes: their detection, localization and possiblefunctions. A u s t. J. P la n t P h ysio l. 27, 489-496.
12 . Lucas, W. J. (1999). Plasmodesmata and the cell-to-cell transport of proteins andnucleoprotein complexes. J. E xp . B o t.50, 979-987.
13. Kehr, J., Haebel, S., Blechschmidt-Schneider, S., Willmitzer, L., Steup, M., andFisahn, J. (1999). Analysis of phloem protein patterns from different organs ofC u c u r b ita m a x im a Duch. by matrix-assisted laser desorption/ionisation time offlight mass spectroscopy combined with sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegel electrophoresis. P la n ta 207, 612-619.
14 . Yoo, B.-C., Lee, J.-Y., and Lucas, W. J. (2002). Analysis of the complexity of protein kinases within the phloem sieve tube system. Characterization of C u cu rb itam a x im a calmodulin-like domain protein kinase 1. J. B io l. Ch em . 277, 15,325-15,332.
15. Iwai, H., Usui, M., Hoshino, H., et al. (2003). Analysis of Sugars in squash xylemsap. P la n t C e ll P h y s io l. 44 , 582-587.
16. Heizmann, U., Kreuzwieser, J., Schnitzler, J.-P., Briiggemann, N., andRennenberg, H. (2001). Assimilate transport in the xylem sap of pedunculate oak{ Q u e r c u s ro b u r ) saplings. P la n t B io l. 3, 132-138.
17. Lopez-Millan, A. F.， Morales, F.， Abad’a, A.， and Abad’a, J. (2000). Effects ofiron deficiency on the composition of the leaf apoplastic fluid and xylem sapin sugar beet, implications for iron and carbon transport. P la n t P h ys io l. 124,873-884.
18 . Alosi, M. C., Melroy, D. L., and Park, R. B. (1988). The regulation of gelation ofphloem exudate from C u c u r b ita fruit by dilution, glutathione, and glutathionereductase. 86, 1089-1094.
19 . King, R. and Zeevaart, J. (1974). Enhancement of phloem exudation from cut petioles by chelating agents. P la n t P h y s io l. 53, 96-103.
20. Hoffmann-Benning, S., Gage, D. A., McIntosh, L., Kende, H., and Zeevaart, J.A. D. (2002). Comparison of peptides in the phloem sap of flowering and nonflowering Perilla and Lupine plants using microbore HPLC followed by matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry. P la n ta216, 140-147.
21. Marentes, E. and Grusak, M. A. (1998). Mass determination of low-molecular-weight proteins in phloem sap using matrix-assisted laser desorption/ionizationtime of flight mass spectrometry. J. E xp . B o t.49, 903-911.
22. Kennedy, J. and Mittler, T. (1953). A method of obtaining phloem sap via themouth parts of aphids. N a tu r e 171, 528.
23. Ishiwatari, Y., Honda, C., Kawashima, I., et al. (1995). Thioredoxin h is one ofthe major proteins in rice phloem sap. P la n ta 195, 456-463.
24. Clark, A. M., Jacobsen, K. R., Bostwick, D. E., Dannenhoffer, J. M., Skaggs, M. I.,and Thompson, G. A. (1997). Molecular characterization of a phloem-specific geneencoding the filament protein, Phloem Protein 1 (PP1), from C u c u r b ita m a xim a .P la n t J. 12, 49-61.
25. Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of thehead of bacteriophage T4. N a tu r e 227, 680-685.
26. Read, S. M. and Northcote, D. H. (1983). Chemical and immunological similarities between the phloem proteins of three genera of the Cucurbitaceae. P la n ta 158,119-127.
27. Read, S. M. and Northcote, D. H. (1983). Subunit structure and interactions ofthe phloem proteins of Cucurbita maxima (pumpkin). E u r. J . B io c h e m . 134,561-569.
28. Christeller, J. T., Farley, P. C., Ramsay, R. J., Sullivan, P. A., and Laing, W. A.(1998). Purification, characterization and cloning of an aspartic proteinase inhibitor from squash phloem exudate. E u r. J . B io c h e m . 254, 160-167.
高等植株的维管束可以运输营养物质，可使相距遥远的植物各部分之间进行交流。这些维管束包含两种运输单元，即木质部和韧皮部。木质部的主要功能是运输水及营养物质到达地上部分；韧皮部用于分配有机同化物，如糖和氨基酸，从生产源运输到植物体的其他部分。在不同植物的木质部和韧皮部的汁液中都发现了蛋白质。
尽管木质部细胞是死细胞，但在健康的和受病原体侵染的植物体中的木质部汁液仍含有低浓度的蛋白质，并且这些蛋白质具有特殊的功能，如用于维护、重建及强化细胞壁，或者用于防御病原体[ 1~5 ]。
构成韧皮部的运输管道称为筛管分子（SE ) 。筛管分子是高度特化的细胞，它没有细胞核和核糖体，因此筛管分子没有转录和翻译的功能。筛管中运输的液体一般被称为韧皮部汁液。在不同植物的韧皮部汁液里，已经发现了 100 多种蛋白质 [6] 。有一定数量的蛋白质已经被鉴别出来 [ 7~11] 。这些蛋白质可能是通过特殊的胞间连丝从紧密联系的伴胞（CC) 中运输过来 [12] 。相对于木质部汁液，韧皮部汁液中的蛋白质浓度达到了一个相当高的水平 （葫芦中高达 60 mg/ml ) [13] 。认为这种蛋白质在韧皮部的维护和防御上起到了一定作用，有些可能在长距离通信上起重要作用。
本章描述如何获得木质部和韧皮部汁液，并如何从中提取蛋白质用于蛋白质组学研究。
2. 材料
2.1 收集木质部汁液
( 1 ) 刀片。
( 2 ) 螺旋盖试管。
( 3 ) 用于收集木质部汁液的容器和冰。
2.2 浓缩木质部汁液蛋白质
( 1 ) 用 Amicon Centriprep YM -3 离心超滤浓缩器和（或）Amicon Centricon Plus-20 离心超滤管过滤装置过滤，并对木质部汁液蛋白质进行部分提纯。
( 2 ) 沉淀蛋白质，在 100% 丙酮中加入 12.5% TCA 并在使用前加入 β-苯巯基乙醇 ( 每 40 ml 含 35 μl β-苯巯基乙醇）或用 80% 丙酮沉淀。
2.3 收集韧皮部汁液
( 1 ) 消过毒的刀片或皮下注射针头。
( 2 ) 滤纸。
( 3 ) 用于收集韧皮部汁液的移液管、反应管和冰。
2.4 提纯韧皮部汁液蛋白
( 1 ) 2 mol/L HCl。
( 2 ) 2 mol/L NaOH ( 分析纯）。
( 3 ) 丙酮/甲醇/DTT [ 90% ( V/V）10% ( V/V）10 mmol/L ] ；100% 丙酮（分析纯 )。
4. 注释
( 1 ) 因为木质部汁液中含有蛋白酶，所以要注意样液必须时刻保持低温状态；可以使用蛋白酶抑制剂。
( 2 ) 番茄植株在汁液流出 6 h 后 ，汁液量会发生很大变化。从健康的、6~7 周大的一株植株中可以得到多于 10 ml 的汁液，但是偶尔从一株植株会取不到任何汁液或者很少量的汁液。植物生长的条件会明显影响汁液的获取量，不过我们还没有发现能够影响汁液获取量的特定条件究竟是什么。从染病的植物中只能得到较少量的汁液。如被维管萎蔫病真菌（尖孢镰刀菌）侵染了的植物。
( 3 ) 蛋白质或糖分的浓度可以被用于测量被韧皮部污染的程度；若木质部中两种物质浓度低，说明木质部汁液纯度高。
( 4 ) 多聚和寡聚糖可以和普通试剂反应来测量蛋白质浓度，像考马斯亮蓝和二喹啉甲酸（BCA，Sigma) 。它们在木质部汁液中会导致对蛋白质含量估算偏髙。
( 5 ) 活体植株中，筛管分子膨压为正，导管分子内膨压为负，所以只有韧皮部汁液可以从这种切口中获得。
( 6 ) 要牢记从切断的茎的有茎叶一侧取得韧皮部汁液，从另一侧（有根一侧）取得木质部汁液。
( 7 ) 因为韧皮部汁液通常含有髙浓度蛋白酶抑制剂，所以不需要加入化学蛋白酶抑制药剂。
( 8 ) 完成沉淀步骤后，检查蛋白质组成（如通过用 1- DE 分析蛋白质沉淀的组成）是很重要的。因为不单是 PP1 和 PP2，其他的蛋白质也会在这个过程中被沉淀。
( 9 ) 不要延长沉淀的时间，延长时间会使蛋白质变成不溶性的。
( 10 ) 用更高的速度离心会带来溶解问题。
( 11 ) 不要通过真空离心干燥，因为这会导致溶解性变差。
( 12 ) 如果沉淀不溶解，孵育更长时间，超声处理或在更高的温度下孵育也许会有效 。如果仍有不溶部分存在，在进行凝胶电泳之前离心样品。
参考文献
1. Rep, M., Dekker, H. L., Vossen, J. H., et al. (2003). A tomato xylem sap proteinrepresents a new family of small cysteine-rich proteins with structural similarity tolipid transfer proteins. F E B S L e tt.534, 82-86.
2 . Rep, M., Dekker, H. L., Vossen, J. H., et al.. (2002). Mass spectrometric identification of isoforms of PR proteins in xylem sap of fungus-infected tomato. P la n tP h y s io l. 1 30 , 904-917.
3. Sakuta, C. and Satoh, S. (2000). Vascular tissue-specific gene expression of xylemsap glycine-rich proteins in root and their localization in the walls of metaxylemvessels in cucumber. P la n t C e ll P h y s io l.41, 627-638.
4. Buhtz, A., Kolasa, A., Arlt, K., Walz, C., Kehr, J. (2004). Xylem sap protein composition is conserved among different plant species. P la n ta 219, 610-618.
5. Kehr, J., Buhtz, A. and Giavalisco, P. (2005). Analysis of xylem sap proteins fromB r a s s ic a n a p u s. B M C P la n t B io l.5, 11.
6. Fukuda, A., Okada, Y., Suzui, N., Fujiwara, T., Yoneyama, T., and Hayashi, H.(2004). Cloning and characterization of the gene for a phloem-specific glutathioneS-transferase from rice leaves. P h ysio l. P la n t. 120, 595-602.
7. Giavalisco, P., Kapitza, K., Kolasa, A., Buhtz, A., and Kehr, J. (2006). Towardsthe proteome of B r a s s ic a n a p u s phloem sap. P r o te o m ic s 6, 896— 909.
8 . Walz, C., Giavalisco, P., Schad, M., Juenger, M., Klose, J., and Kehr, J. (2004).Proteomics of curcurbit phloem exudate reveals a network of defence proteins.P h y to c h e m is tr y 6 5 , 1795-1804.
9 . Haebel, S. and Kehr, J. (2001). Matrix-assisted laser desorption/ionization time offlight mass spectrometry peptide mass fingerprints and post source decay: a toolfor the identification and analysis of phloem proteins from C u c u r b ita m a xim aDuch. separated by two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. P la n ta213, 586-593.
10 . Barnes, A., Bale, J., Constantinidou, C., Ashton, P., Jones, A., and Pritchard, J.(2004). Determining protein identity from sieve element sap in R ic in u s co m m u n isL. by quadrupole time of flight (Q-TOF) mass spectrometry. J. E xp . B o t. 55,1473-1481.
11. Hayashi, H., Fukuda, A., Suzui, N., and Fujimaki, S. (2000). Proteins in the sieveelement-companion cell complexes: their detection, localization and possiblefunctions. A u s t. J. P la n t P h ysio l. 27, 489-496.
12 . Lucas, W. J. (1999). Plasmodesmata and the cell-to-cell transport of proteins andnucleoprotein complexes. J. E xp . B o t.50, 979-987.
13. Kehr, J., Haebel, S., Blechschmidt-Schneider, S., Willmitzer, L., Steup, M., andFisahn, J. (1999). Analysis of phloem protein patterns from different organs ofC u c u r b ita m a x im a Duch. by matrix-assisted laser desorption/ionisation time offlight mass spectroscopy combined with sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegel electrophoresis. P la n ta 207, 612-619.
14 . Yoo, B.-C., Lee, J.-Y., and Lucas, W. J. (2002). Analysis of the complexity of protein kinases within the phloem sieve tube system. Characterization of C u cu rb itam a x im a calmodulin-like domain protein kinase 1. J. B io l. Ch em . 277, 15,325-15,332.
15. Iwai, H., Usui, M., Hoshino, H., et al. (2003). Analysis of Sugars in squash xylemsap. P la n t C e ll P h y s io l. 44 , 582-587.
16. Heizmann, U., Kreuzwieser, J., Schnitzler, J.-P., Briiggemann, N., andRennenberg, H. (2001). Assimilate transport in the xylem sap of pedunculate oak{ Q u e r c u s ro b u r ) saplings. P la n t B io l. 3, 132-138.
17. Lopez-Millan, A. F.， Morales, F.， Abad’a, A.， and Abad’a, J. (2000). Effects ofiron deficiency on the composition of the leaf apoplastic fluid and xylem sapin sugar beet, implications for iron and carbon transport. P la n t P h ys io l. 124,873-884.
18 . Alosi, M. C., Melroy, D. L., and Park, R. B. (1988). The regulation of gelation ofphloem exudate from C u c u r b ita fruit by dilution, glutathione, and glutathionereductase. 86, 1089-1094.
19 . King, R. and Zeevaart, J. (1974). Enhancement of phloem exudation from cut petioles by chelating agents. P la n t P h y s io l. 53, 96-103.
20. Hoffmann-Benning, S., Gage, D. A., McIntosh, L., Kende, H., and Zeevaart, J.A. D. (2002). Comparison of peptides in the phloem sap of flowering and nonflowering Perilla and Lupine plants using microbore HPLC followed by matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry. P la n ta216, 140-147.
21. Marentes, E. and Grusak, M. A. (1998). Mass determination of low-molecular-weight proteins in phloem sap using matrix-assisted laser desorption/ionizationtime of flight mass spectrometry. J. E xp . B o t.49, 903-911.
22. Kennedy, J. and Mittler, T. (1953). A method of obtaining phloem sap via themouth parts of aphids. N a tu r e 171, 528.
23. Ishiwatari, Y., Honda, C., Kawashima, I., et al. (1995). Thioredoxin h is one ofthe major proteins in rice phloem sap. P la n ta 195, 456-463.
24. Clark, A. M., Jacobsen, K. R., Bostwick, D. E., Dannenhoffer, J. M., Skaggs, M. I.,and Thompson, G. A. (1997). Molecular characterization of a phloem-specific geneencoding the filament protein, Phloem Protein 1 (PP1), from C u c u r b ita m a xim a .P la n t J. 12, 49-61.
25. Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of thehead of bacteriophage T4. N a tu r e 227, 680-685.
26. Read, S. M. and Northcote, D. H. (1983). Chemical and immunological similarities between the phloem proteins of three genera of the Cucurbitaceae. P la n ta 158,119-127.
27. Read, S. M. and Northcote, D. H. (1983). Subunit structure and interactions ofthe phloem proteins of Cucurbita maxima (pumpkin). E u r. J . B io c h e m . 134,561-569.
28. Christeller, J. T., Farley, P. C., Ramsay, R. J., Sullivan, P. A., and Laing, W. A.(1998). Purification, characterization and cloning of an aspartic proteinase inhibitor from squash phloem exudate. E u r. J . B io c h e m . 254, 160-167.
