材料与仪器
韧皮部汁液
HCl NaOH 丙酮 甲醇 DTT β-苯巯基乙醇
刀片 螺旋盖试管
HCl NaOH 丙酮 甲醇 DTT β-苯巯基乙醇
刀片 螺旋盖试管
步骤
3.1 收集木质部汁液
木质部汁液属于植物细胞外空间，含有的特殊蛋白质的种类和浓度随植物的状态而变化。因为纯净的木质部汁液容易从大多数植物中得到，所以容易用蛋白质组学工具进行木质部汁液蛋白质的鉴别。准备进行单向电泳（1- DE) 或双向电泳（2- DE) 分离的蛋白质样品时，要考虑到蛋白浓度很低，且含有低聚糖（及糖基化蛋白）。用 1- DE 或 2- DE 进行木质部汁液蛋白质样品分析，有两个基本步骤，即收集木质部汁液和浓缩蛋白质。
( 1 ) 用刀片切割植物的茎，收集从根侧茎中自然流出的汁液（由于根压流出）（图 4-1)。植物的茎可以在任何髙度被切割，不过通常来讲，切割部位离茎基部越近，流出的汁液量越大。但是莲的切口要达到一定高度（大约 10 cm) 以便连接一个放在冰中的管子（见注释 1)。
( 2 ) 汁液收集。
a. 将剩下的茎段水平放置，把一根管子接在切口处。管子放在一个装有冰块的容器中，然后收集汁液达 6 h ( 图 4-1C；在汁液收集的过程中，容器冰块需补充；见注释 2 ) 。
b. 另一种方法是，渗出的木质部汁液可以每隔几分钟用移液管重复收集，液体收集到放置在冰块上的反应管里。
( 3 ) 收集汁液前要清洗切口，以除去被切细胞的细胞质和切割韧皮部时直接流出的汁液（见注释 3) 。
( 4 ) 在浓缩蛋白质前，可以用离心的方法除去颗粒状物质，像土壤颗粒、微生物细胞或残留的组织。
3.2 浓缩木质部汁液蛋白
木质部汁液不但含有蛋白质，也包含碳水化合物（见注释 4 ) 和其他化合物，如氨基酸、盐及多酚（在被病原体侵染的植株中 )。
如果进行 1-DE，简单的蛋白质沉淀就可以，甚至可以用乙醇（4 份 95% 乙醇/5% 0.1 mol/L NaAc 加入 1 份蛋白质样品中），尽管乙醇也可以沉淀多聚和低聚糖。
如果进行等电聚焦，汁液应该用 Amicon 过滤装置进行部分提纯和浓缩，之后用 TCA /丙酮进行沉淀。
1. 用 Amicon 过滤装置进行蛋白质的部分提纯和浓缩
用 Amicon CentriprepYM-3 离心超滤浓缩器（最多 15 ml，自动开关：3kDa) 和 ( 或）Amicon Centricon Plus-20 离心超滤管（更大的容积，自动开关：10kDa) 过滤装置 ，对木质部汁液进行浓缩及部分提纯。
( 1 ) 离心后除去微粒状物质，将最多 15 ml ( AmiconCentriprepYM- 3 ) 或者 19 ml ( Amicon Centricon Plus-20 ) 木质部汁液加入样品容器中。
( 2 ) 在 4°C、3000 g 旋转 Amicon Centriprep YM -3 75 min 直到达到平衡（过滤收集器里外液面之间）。
( 3 ) 在 4°C 旋转 Amicon Centricon Plus-20，4000 g，15 min。轻轻倒出滤液，再加入 19 ml 木质部汁液到样品过滤杯中。
( 4 ) 再旋转 15 min。
( 5 ) 轻轻倒出滤液，如果需要进一步浓缩，则重复旋转和倒出滤液的步骤。
( 6 ) 直接从 Centriprep YM-3 中收集浓缩液（至少 500 μl )。
( 7 ) 在 1000 g 旋转倒置部分（inverted unit) 5 min，从 Centricon Plus-20 收集浓缩液（至少 200 μl ) 。
2. 用 TCA / 丙酮沉淀蛋白质
( 1 ) 将 4 份 100% 丙酮溶液（含 12.5% TCA 和 0.0875% β-巯基乙醇）加入 1 份蛋白质中，并混合。
( 2 ) 在 -20°C 反应 45 min 以上（或用 80% 丙酮在 0°C 反 应 1~4 h) ，然后用离心机的最快速度离心 30 min ( 不需冷冻）。
( 3 ) 弃掉上清液，并用冰冷的 100% 丙酮漂洗沉淀 3 次。
( 4 ) 除去残留液体，室温晾干沉淀。沉淀可溶于重悬缓冲液（2 mol/L 硫脲、7 mol/L 尿素、4% CHAPS、2% mmol/L DTT )[ 5 ] 后用于等电聚焦，或保存在 -20°C。
3.3 收集韧皮部汁液
韧皮部汁液比木质部汁液更难从大部分植物体中收集。因此，韧皮部汁液蛋白组学的主要难题是收集足够多的材料。不过，可根据不同植物物种的特性应用不同的采集方法。
对于一些植物物种（如蓖麻、葫芦科植物、丝兰），切小切口或割开整个植物器官 [18] 可以收集韧皮部汁液。不适宜这种收集方法的植物可以通过 EDTA 辅助分泌法 [ 19~21] 取样。许多植物都可以用蚜口针技术 [ 22 ] 得到高纯度的韧皮部汁液，但是量很少。
已经被确立的模式植物，像拟南芥或是水稻，很难采集到足够量的筛管分子渗出液用于蛋白质组研究。对于拟南芥而言，可得到的样品量不足以用于蛋白质组学的研究方法 [ 10] ，对于水稻而言，只有一些高丰度的韧皮部汁液蛋白质能够通过 planthopper 口针渗出液 [ 6，23] 被鉴别出来。大部分目前关于鉴别韧皮部多肽的信息来自于葫芦 [ 8 ] 、蓖麻 [ 10] ，最近又从油菜 [ 7 ] 得到了相关信息。
收集这些植物的韧皮部汁液要相对容易。两种版本的渗出技术（exudation technique) 描述如下所述。
1 . 版本 1
( 1 ) 用刀片切割植物的主茎或叶柄（图 4-2)。
( 2 ) 将注射针头穿刺植物体（见注释 5) 。
2 . 版本 2
( 1 ) 切割后使用地上部分一侧的断莲，用滤纸吸干切口（见注释 6 )。
( 2 ) 用滤纸吸去最先渗出的液滴。
将随后渗出的汁液吸取收集到一个保存在冰中的反应管（见注释 7)。
3.4 韧皮部汁液蛋白质的提纯
( 1 ) 在 1-DE 或 2-DE 中分离韧皮部蛋白质时，必须考虑到运输液中的高浓度糖和有机物。另外，植物对切割有御伤机制，其中包括蛋白质聚合作用 [ 24 ]。
( 2 ) 对于 1-DE 来说，韧皮部样液可以被直接加进 1-DE 样品缓冲液「25」，加热，并在室温下进行凝胶电泳。
( 3 ) 对于 2-DE，在样液用于进行等电聚焦电泳之前，蛋白质应该通过沉淀的方法提纯。
1. 去除韧皮部主要的蛋白质 1 ( PP1 ) 和蛋白质 2 ( PP2)
两种主要的韧皮部蛋白质——韧皮部丝状蛋白 PP1 和韧皮部凝集素 PP2 存在于所有双子叶植物中，并在一些植物中占全部韧皮部蛋白质的 50% 以上（如葫芦科植物）。
在氧化条件下，两种蛋白质通过二硫键形成不溶性聚合物 [ 26，27] ，它们会在 1-DE 和 2-DE 中形成拖尾，使分辨率下降。要移除这些蛋白质，可以使用先酸化再中和的方法 [28] 。以下的所有步骤都在室温下完成。
（1 ) 用 2 mol/L HCl 标定样液到 pH 2.0。
( 2 ) 用 2 mol/L NaOH 中和样液到 pH 7.5。
( 3 ) 在 15 000 g 离心 15 min。
( 4 ) 收集上清液并去掉含有 PP1 和 PP2 的大量白色沉淀（见注释 8) 。
2. 用丙酮/甲醇/ DTT 沉淀全部初皮部汁液蛋白质
要移除碳水化合物和其他干扰成分，可以用丙酮/甲醇/DTT 处理使蛋白质沉淀。
( 1 ) 加入 3 倍体积预冷沉淀液。
( 2 ) 在 -20℃ 沉淀一夜（见注释 9) 。
( 3 ) 在 6800 g、4°C 离心 5 min ( 见注释 10 ) 并丢掉上清液。
( 4 ) 用 100% 预冷丙酮漂洗沉淀物两次，并在 6800 g 4°C 离心 5 min。
( 5 ) 除掉上清液，室温晾干沉淀 5~10 min ( 见注释 11)。
( 6 ) 将沉淀在样品缓冲液中被溶解，用于 1-DE 和 2-DE ( 见注释 12)。
木质部汁液属于植物细胞外空间，含有的特殊蛋白质的种类和浓度随植物的状态而变化。因为纯净的木质部汁液容易从大多数植物中得到，所以容易用蛋白质组学工具进行木质部汁液蛋白质的鉴别。准备进行单向电泳（1- DE) 或双向电泳（2- DE) 分离的蛋白质样品时，要考虑到蛋白浓度很低，且含有低聚糖（及糖基化蛋白）。用 1- DE 或 2- DE 进行木质部汁液蛋白质样品分析，有两个基本步骤，即收集木质部汁液和浓缩蛋白质。
( 1 ) 用刀片切割植物的茎，收集从根侧茎中自然流出的汁液（由于根压流出）（图 4-1)。植物的茎可以在任何髙度被切割，不过通常来讲，切割部位离茎基部越近，流出的汁液量越大。但是莲的切口要达到一定高度（大约 10 cm) 以便连接一个放在冰中的管子（见注释 1)。
( 2 ) 汁液收集。
a. 将剩下的茎段水平放置，把一根管子接在切口处。管子放在一个装有冰块的容器中，然后收集汁液达 6 h ( 图 4-1C；在汁液收集的过程中，容器冰块需补充；见注释 2 ) 。
b. 另一种方法是，渗出的木质部汁液可以每隔几分钟用移液管重复收集，液体收集到放置在冰块上的反应管里。
( 3 ) 收集汁液前要清洗切口，以除去被切细胞的细胞质和切割韧皮部时直接流出的汁液（见注释 3) 。
( 4 ) 在浓缩蛋白质前，可以用离心的方法除去颗粒状物质，像土壤颗粒、微生物细胞或残留的组织。
3.2 浓缩木质部汁液蛋白
木质部汁液不但含有蛋白质，也包含碳水化合物（见注释 4 ) 和其他化合物，如氨基酸、盐及多酚（在被病原体侵染的植株中 )。
如果进行 1-DE，简单的蛋白质沉淀就可以，甚至可以用乙醇（4 份 95% 乙醇/5% 0.1 mol/L NaAc 加入 1 份蛋白质样品中），尽管乙醇也可以沉淀多聚和低聚糖。
如果进行等电聚焦，汁液应该用 Amicon 过滤装置进行部分提纯和浓缩，之后用 TCA /丙酮进行沉淀。
1. 用 Amicon 过滤装置进行蛋白质的部分提纯和浓缩
用 Amicon CentriprepYM-3 离心超滤浓缩器（最多 15 ml，自动开关：3kDa) 和 ( 或）Amicon Centricon Plus-20 离心超滤管（更大的容积，自动开关：10kDa) 过滤装置 ，对木质部汁液进行浓缩及部分提纯。
( 1 ) 离心后除去微粒状物质，将最多 15 ml ( AmiconCentriprepYM- 3 ) 或者 19 ml ( Amicon Centricon Plus-20 ) 木质部汁液加入样品容器中。
( 2 ) 在 4°C、3000 g 旋转 Amicon Centriprep YM -3 75 min 直到达到平衡（过滤收集器里外液面之间）。
( 3 ) 在 4°C 旋转 Amicon Centricon Plus-20，4000 g，15 min。轻轻倒出滤液，再加入 19 ml 木质部汁液到样品过滤杯中。
( 4 ) 再旋转 15 min。
( 5 ) 轻轻倒出滤液，如果需要进一步浓缩，则重复旋转和倒出滤液的步骤。
( 6 ) 直接从 Centriprep YM-3 中收集浓缩液（至少 500 μl )。
( 7 ) 在 1000 g 旋转倒置部分（inverted unit) 5 min，从 Centricon Plus-20 收集浓缩液（至少 200 μl ) 。
2. 用 TCA / 丙酮沉淀蛋白质
( 1 ) 将 4 份 100% 丙酮溶液（含 12.5% TCA 和 0.0875% β-巯基乙醇）加入 1 份蛋白质中，并混合。
( 2 ) 在 -20°C 反应 45 min 以上（或用 80% 丙酮在 0°C 反 应 1~4 h) ，然后用离心机的最快速度离心 30 min ( 不需冷冻）。
( 3 ) 弃掉上清液，并用冰冷的 100% 丙酮漂洗沉淀 3 次。
( 4 ) 除去残留液体，室温晾干沉淀。沉淀可溶于重悬缓冲液（2 mol/L 硫脲、7 mol/L 尿素、4% CHAPS、2% mmol/L DTT )[ 5 ] 后用于等电聚焦，或保存在 -20°C。
3.3 收集韧皮部汁液
韧皮部汁液比木质部汁液更难从大部分植物体中收集。因此，韧皮部汁液蛋白组学的主要难题是收集足够多的材料。不过，可根据不同植物物种的特性应用不同的采集方法。
对于一些植物物种（如蓖麻、葫芦科植物、丝兰），切小切口或割开整个植物器官 [18] 可以收集韧皮部汁液。不适宜这种收集方法的植物可以通过 EDTA 辅助分泌法 [ 19~21] 取样。许多植物都可以用蚜口针技术 [ 22 ] 得到高纯度的韧皮部汁液，但是量很少。
已经被确立的模式植物，像拟南芥或是水稻，很难采集到足够量的筛管分子渗出液用于蛋白质组研究。对于拟南芥而言，可得到的样品量不足以用于蛋白质组学的研究方法 [ 10] ，对于水稻而言，只有一些高丰度的韧皮部汁液蛋白质能够通过 planthopper 口针渗出液 [ 6，23] 被鉴别出来。大部分目前关于鉴别韧皮部多肽的信息来自于葫芦 [ 8 ] 、蓖麻 [ 10] ，最近又从油菜 [ 7 ] 得到了相关信息。
收集这些植物的韧皮部汁液要相对容易。两种版本的渗出技术（exudation technique) 描述如下所述。
1 . 版本 1
( 1 ) 用刀片切割植物的主茎或叶柄（图 4-2)。
( 2 ) 将注射针头穿刺植物体（见注释 5) 。
2 . 版本 2
( 1 ) 切割后使用地上部分一侧的断莲，用滤纸吸干切口（见注释 6 )。
( 2 ) 用滤纸吸去最先渗出的液滴。
将随后渗出的汁液吸取收集到一个保存在冰中的反应管（见注释 7)。
3.4 韧皮部汁液蛋白质的提纯
( 1 ) 在 1-DE 或 2-DE 中分离韧皮部蛋白质时，必须考虑到运输液中的高浓度糖和有机物。另外，植物对切割有御伤机制，其中包括蛋白质聚合作用 [ 24 ]。
( 2 ) 对于 1-DE 来说，韧皮部样液可以被直接加进 1-DE 样品缓冲液「25」，加热，并在室温下进行凝胶电泳。
( 3 ) 对于 2-DE，在样液用于进行等电聚焦电泳之前，蛋白质应该通过沉淀的方法提纯。
1. 去除韧皮部主要的蛋白质 1 ( PP1 ) 和蛋白质 2 ( PP2)
两种主要的韧皮部蛋白质——韧皮部丝状蛋白 PP1 和韧皮部凝集素 PP2 存在于所有双子叶植物中，并在一些植物中占全部韧皮部蛋白质的 50% 以上（如葫芦科植物）。
在氧化条件下，两种蛋白质通过二硫键形成不溶性聚合物 [ 26，27] ，它们会在 1-DE 和 2-DE 中形成拖尾，使分辨率下降。要移除这些蛋白质，可以使用先酸化再中和的方法 [28] 。以下的所有步骤都在室温下完成。
（1 ) 用 2 mol/L HCl 标定样液到 pH 2.0。
( 2 ) 用 2 mol/L NaOH 中和样液到 pH 7.5。
( 3 ) 在 15 000 g 离心 15 min。
( 4 ) 收集上清液并去掉含有 PP1 和 PP2 的大量白色沉淀（见注释 8) 。
2. 用丙酮/甲醇/ DTT 沉淀全部初皮部汁液蛋白质
要移除碳水化合物和其他干扰成分，可以用丙酮/甲醇/DTT 处理使蛋白质沉淀。
( 1 ) 加入 3 倍体积预冷沉淀液。
( 2 ) 在 -20℃ 沉淀一夜（见注释 9) 。
( 3 ) 在 6800 g、4°C 离心 5 min ( 见注释 10 ) 并丢掉上清液。
( 4 ) 用 100% 预冷丙酮漂洗沉淀物两次，并在 6800 g 4°C 离心 5 min。
( 5 ) 除掉上清液，室温晾干沉淀 5~10 min ( 见注释 11)。
( 6 ) 将沉淀在样品缓冲液中被溶解，用于 1-DE 和 2-DE ( 见注释 12)。
来源：丁香实验
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