三氯乙酸-丙酮法提取植物全蛋白
丁香园
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1. 前言
在蛋白质组研究中，双向电泳图谱的比较占有重要地位。双向电泳必须能很好地分离各个蛋白质，应尽量避免拖尾、横纹或因蛋白质降解而产生的假相。蛋白质在图谱上的分布模式必须是可重复的。蛋白质样品的制备是这些条件得以保持的重要前提。植物蛋白提取的难点在于植物细胞中蛋白质的含量低，同时还含有很多干扰蛋白提取的有机物 ，如酚类、色素、脂类及核酸等 [1] 。提取出的蛋白必须溶解在与等电聚焦 （IEF ) 电泳缓冲系统兼容的样品溶液中。
经过在各种植物组织中的试验，我们建立了一种以三氯乙酸和丙酮使蛋白质变性并沉淀的提取方法。本方法起源于 Wu 和 Wang [ 2] 最初关于三氯乙酸沉淀蛋白质能高效抑制蛋白酶活性的报道。提取出来的蛋白质最后溶解在尿素-碳酸钾-SDS (UKS )[ 3] 溶液中。用本方法提取的蛋白质样品在电泳中具有很好的重复性，同时对于高分子质量和髙等电点的蛋白质也有很好的分辨率，因而被广泛使用，且命名为三氯乙酸/丙酮法[ 4, 5 ] 。
UKS 样品缓冲液适合用于最初的自制管胶进行的等电聚焦电泳。这种自制管胶进行等电聚焦时，pH 梯度是在施加电压后由两性电解质移动形成。20 世纪 90 年代开始出现的商品化的 IPG 胶条用于等电聚焦电泳，大大提高了电泳的重复性，因而被广泛使用。
然而，使 用 IPG 胶条进行等电聚焦时，需要施加很高的电压，而 UKS 溶液中的高含盐量和 SDS 使得该缓冲液不适合这种等电聚焦系统 [6]，因而必须采用新的样品缓冲液。
本章，我们将着重描述分别为进行传统的等电聚焦和现代的 IPG 等电聚焦电泳制备样品所采用的不同步骤。
2. 材料
2.1 蛋白沉淀溶液
含 10% (m/V） 三氯乙酸和 0.07% β-巯基乙醇（2ME) （V/V ) 的丙酮（低温）。应在使用前新鲜配制，并置于 -20°C 条件下直到使用（见注释 1)。
注意：3 种试剂均有毒，必须在通风橱中配制。
2.2 清洗溶液
含 0.07% 2ME（V/V ) 的丙酮，可在 -20°C 下贮存约 1 个月。
2.3 R2D2 蛋白质溶解缓冲液
5 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、2% 3- [ 3 - ( 胆酰胺丙基）二甲氨基 ] 丙磺酸内盐 ( CHAPS；m/V ) 、2% 癸基二甲基铵基丙烷硫酸盐（SB 3-10) ( m/V ) 、20 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT ) 、5 mmol/L 磷化氢、0.5% 两性电解质 ( V/V） pH 4~6.5、0.25% 两性电解质（pharmalyte) ( V/V ) pH 3~10，以双蒸水配制。配制时可以稍微加热 （不高于 30°C，见注释 2 ) 以溶解尿素。配制好的溶液可以分装保存在 -80°C 下数月（ 注释 3) 。
2.4 UKS 蛋白质溶解缓冲液
9.5 mol/L 尿素、5 mmol/L K2CO3、1.25% SDS、5% DTT、6% Triton X-100、2% 两性电解质（ ampholines) pH 3.5~9.5，以双蒸水配制。K2CO3 可以配制成 2.8%(m/V ) 、SDS 配制成 10% ( m/V ) (过滤）、Triton X-100配制成 20% 的贮存液，加入其他成分和 3 ml 双蒸水直到尿素溶解（可加热至 30°C 以下，见注释 2) 。配制好的溶液可以分装保存在 -80°C 条件下数月。
2.5 蛋白质浓度测定
溶解于 UKS 或 R2D2 中的蛋白质可以用 Amersham Biosciences 的 2-D Quant 试剂盒进行定量。该方法的主要原理是先将蛋白质沉淀，然后用铜离子与蛋白质进行特异结合，具体过程参见产品说明书（ ref. 80-6483-56)。该方法与绝大多数在蛋白质制备过程中使用的试剂都兼容。
2.6 IPG 胶条水化液（仅适用于 UKS 制备的样品）
( 1 ) 溶液 A : 7 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、1.4% CHAPS (m/V ) 、16 mmol/L DTT、5 mmol/L 磷化氢、0.3% 两性电解质（ pharmalyte) pH 3~10 ( V/V ) ，双蒸水配制。
( 2 ) 溶液 B : 7 mol/L 尿素 、2 mol/L 硫脲、0.5% CHAPS (m/V ) 、10 mmol/L DTT、5 mmol/L 磷化氢，双蒸水配制。
4. 注释
( 1 ) 蛋白质沉淀剂和重悬液在使用前必须预冷。始终将丙酮溶液放在 4℃ 条件下。
( 2 ) UKS 和 R2D2 溶液中均含有较高浓度的尿素，需要稍微加热溶解。但切记加热温度不可超过 30°C，否则尿素会裂解产生异硫氰酸从而导致蛋白质的氨甲酰化。
( 3 ) SB 3-10 在尿素中很难溶解（这也是为什么尿素浓度限制在 5 mol/L 的原因），因此在解冻 R2D2 溶液时需要较长时间，必须待溶液完全澄清后方可使用。
( 4 ) 要想获得较高的蛋白质提取效率，必须将植物组织预先研磨成非常细小的粉末 。对于某些坚硬的植物组织（ 如玉米粒），在研磨前必须先将其破碎。也可以用加有金属小球（6 mm 直径）的自动粉碎机进行磨样。
( 5 ) 在蛋白质干燥前，所有操作都必须在低温下（ 低于 4°C ) 进行以免蛋白酶降解蛋白质。
( 6 ) 对于含色素较多的样品，可以增加清洗的次数，或者延长清洗的时间（过夜），以最后得到白色的沉淀。
( 7 ) 也可以将蛋白质干粉冻存在 -80°C 条件下，但是将干粉取出进行溶解前，最好再次进行干燥。
( 8 ) 根据所需样品的体积量决定水化前是选择溶液 A 还是溶液 B 。当只需要 20~90 μl 样品量时，用溶液 A 去稀释溶解在 UKS 中的蛋白质样品，当需要较大体积的样品量时，选择溶液 B。这样可以控制合适的离子浓度进行 IPG 等电聚焦。
参考文献
1. Damerval, C., Zivy, M., Granier, F., and de Vienne, D. (1988) Two-dimensionalelectrophoresis in plant biology, in Advances in electrophoresis (Chrambach, A.,Dunn, M., and Radola, B., eds.), VCH, Weinheim, New York, pp. 265-340.
2. Wu, F. and Wang, M. (1984) Extraction of proteins for sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis from protease-rich plant tissues. Anal.Biochem. 1 39 , 100-103.
3. Damerval, C., de Vienne, D., Zivy, M., and Thiellement, H. (1986) Technicalimprovements in two-dimensional electrophoresis increase the level of geneticvariation detected in wheat seedling proteins. Electrophoresis 7, 52-54.
4. Saravanan, R. S. and Rose, J. K. (2004) A critical evaluation of sample extractiontechniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant plant tissues. Proteomics4, 2522-2532.
5. Carpentier, S. C., Witters, E., Laukens, K., Deckers, P., Swennen, R., and Panis, B.(2005) Preparation of protein extracts from recalcitrant plant tissues: an evaluationof different methods for two-dimensional gel electrophoresis analysis. Proteomics5 , 2497-2507.
6. Mechin, V., Consoli, L., Le Guilloux, M., and Damerval, C. (2003) An efficientsolubilization buffer for plant proteins focused in immobilized pH gradients.Proteomics 3, 1299-1302.
7. Hurkman, W. and Tanaka, C. (1986) Solubilization of plant membrane proteins foranalysis by two-dimensional gel electrophoresis. Plant Physiol. 8 1, 802-806.
8 . Granier, F. (1988) Extraction of plant proteins for two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis 9 , 712-718.
9. Herbert, B. (1999) Advances in protein solubilisation for two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis 20, 660-663.
10 . Colas des Francs, C., Thiellement, H., and de Vienne, D. (1985) Analysis of leafproteins by two-dimensional gel electrophoresis: protease action as exemplifiedby ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase degradation and procedure toavoid proteolysis during extraction. Plant Physiol. 78, 178-182.
在蛋白质组研究中，双向电泳图谱的比较占有重要地位。双向电泳必须能很好地分离各个蛋白质，应尽量避免拖尾、横纹或因蛋白质降解而产生的假相。蛋白质在图谱上的分布模式必须是可重复的。蛋白质样品的制备是这些条件得以保持的重要前提。植物蛋白提取的难点在于植物细胞中蛋白质的含量低，同时还含有很多干扰蛋白提取的有机物 ，如酚类、色素、脂类及核酸等 [1] 。提取出的蛋白必须溶解在与等电聚焦 （IEF ) 电泳缓冲系统兼容的样品溶液中。
经过在各种植物组织中的试验，我们建立了一种以三氯乙酸和丙酮使蛋白质变性并沉淀的提取方法。本方法起源于 Wu 和 Wang [ 2] 最初关于三氯乙酸沉淀蛋白质能高效抑制蛋白酶活性的报道。提取出来的蛋白质最后溶解在尿素-碳酸钾-SDS (UKS )[ 3] 溶液中。用本方法提取的蛋白质样品在电泳中具有很好的重复性，同时对于高分子质量和髙等电点的蛋白质也有很好的分辨率，因而被广泛使用，且命名为三氯乙酸/丙酮法[ 4, 5 ] 。
UKS 样品缓冲液适合用于最初的自制管胶进行的等电聚焦电泳。这种自制管胶进行等电聚焦时，pH 梯度是在施加电压后由两性电解质移动形成。20 世纪 90 年代开始出现的商品化的 IPG 胶条用于等电聚焦电泳，大大提高了电泳的重复性，因而被广泛使用。
然而，使 用 IPG 胶条进行等电聚焦时，需要施加很高的电压，而 UKS 溶液中的高含盐量和 SDS 使得该缓冲液不适合这种等电聚焦系统 [6]，因而必须采用新的样品缓冲液。
本章，我们将着重描述分别为进行传统的等电聚焦和现代的 IPG 等电聚焦电泳制备样品所采用的不同步骤。
2. 材料
2.1 蛋白沉淀溶液
含 10% (m/V） 三氯乙酸和 0.07% β-巯基乙醇（2ME) （V/V ) 的丙酮（低温）。应在使用前新鲜配制，并置于 -20°C 条件下直到使用（见注释 1)。
注意：3 种试剂均有毒，必须在通风橱中配制。
2.2 清洗溶液
含 0.07% 2ME（V/V ) 的丙酮，可在 -20°C 下贮存约 1 个月。
2.3 R2D2 蛋白质溶解缓冲液
5 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、2% 3- [ 3 - ( 胆酰胺丙基）二甲氨基 ] 丙磺酸内盐 ( CHAPS；m/V ) 、2% 癸基二甲基铵基丙烷硫酸盐（SB 3-10) ( m/V ) 、20 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT ) 、5 mmol/L 磷化氢、0.5% 两性电解质 ( V/V） pH 4~6.5、0.25% 两性电解质（pharmalyte) ( V/V ) pH 3~10，以双蒸水配制。配制时可以稍微加热 （不高于 30°C，见注释 2 ) 以溶解尿素。配制好的溶液可以分装保存在 -80°C 下数月（ 注释 3) 。
2.4 UKS 蛋白质溶解缓冲液
9.5 mol/L 尿素、5 mmol/L K2CO3、1.25% SDS、5% DTT、6% Triton X-100、2% 两性电解质（ ampholines) pH 3.5~9.5，以双蒸水配制。K2CO3 可以配制成 2.8%(m/V ) 、SDS 配制成 10% ( m/V ) (过滤）、Triton X-100配制成 20% 的贮存液，加入其他成分和 3 ml 双蒸水直到尿素溶解（可加热至 30°C 以下，见注释 2) 。配制好的溶液可以分装保存在 -80°C 条件下数月。
2.5 蛋白质浓度测定
溶解于 UKS 或 R2D2 中的蛋白质可以用 Amersham Biosciences 的 2-D Quant 试剂盒进行定量。该方法的主要原理是先将蛋白质沉淀，然后用铜离子与蛋白质进行特异结合，具体过程参见产品说明书（ ref. 80-6483-56)。该方法与绝大多数在蛋白质制备过程中使用的试剂都兼容。
2.6 IPG 胶条水化液（仅适用于 UKS 制备的样品）
( 1 ) 溶液 A : 7 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、1.4% CHAPS (m/V ) 、16 mmol/L DTT、5 mmol/L 磷化氢、0.3% 两性电解质（ pharmalyte) pH 3~10 ( V/V ) ，双蒸水配制。
( 2 ) 溶液 B : 7 mol/L 尿素 、2 mol/L 硫脲、0.5% CHAPS (m/V ) 、10 mmol/L DTT、5 mmol/L 磷化氢，双蒸水配制。
4. 注释
( 1 ) 蛋白质沉淀剂和重悬液在使用前必须预冷。始终将丙酮溶液放在 4℃ 条件下。
( 2 ) UKS 和 R2D2 溶液中均含有较高浓度的尿素，需要稍微加热溶解。但切记加热温度不可超过 30°C，否则尿素会裂解产生异硫氰酸从而导致蛋白质的氨甲酰化。
( 3 ) SB 3-10 在尿素中很难溶解（这也是为什么尿素浓度限制在 5 mol/L 的原因），因此在解冻 R2D2 溶液时需要较长时间，必须待溶液完全澄清后方可使用。
( 4 ) 要想获得较高的蛋白质提取效率，必须将植物组织预先研磨成非常细小的粉末 。对于某些坚硬的植物组织（ 如玉米粒），在研磨前必须先将其破碎。也可以用加有金属小球（6 mm 直径）的自动粉碎机进行磨样。
( 5 ) 在蛋白质干燥前，所有操作都必须在低温下（ 低于 4°C ) 进行以免蛋白酶降解蛋白质。
( 6 ) 对于含色素较多的样品，可以增加清洗的次数，或者延长清洗的时间（过夜），以最后得到白色的沉淀。
( 7 ) 也可以将蛋白质干粉冻存在 -80°C 条件下，但是将干粉取出进行溶解前，最好再次进行干燥。
( 8 ) 根据所需样品的体积量决定水化前是选择溶液 A 还是溶液 B 。当只需要 20~90 μl 样品量时，用溶液 A 去稀释溶解在 UKS 中的蛋白质样品，当需要较大体积的样品量时，选择溶液 B。这样可以控制合适的离子浓度进行 IPG 等电聚焦。
参考文献
1. Damerval, C., Zivy, M., Granier, F., and de Vienne, D. (1988) Two-dimensionalelectrophoresis in plant biology, in Advances in electrophoresis (Chrambach, A.,Dunn, M., and Radola, B., eds.), VCH, Weinheim, New York, pp. 265-340.
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4. Saravanan, R. S. and Rose, J. K. (2004) A critical evaluation of sample extractiontechniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant plant tissues. Proteomics4, 2522-2532.
5. Carpentier, S. C., Witters, E., Laukens, K., Deckers, P., Swennen, R., and Panis, B.(2005) Preparation of protein extracts from recalcitrant plant tissues: an evaluationof different methods for two-dimensional gel electrophoresis analysis. Proteomics5 , 2497-2507.
6. Mechin, V., Consoli, L., Le Guilloux, M., and Damerval, C. (2003) An efficientsolubilization buffer for plant proteins focused in immobilized pH gradients.Proteomics 3, 1299-1302.
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8 . Granier, F. (1988) Extraction of plant proteins for two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis 9 , 712-718.
9. Herbert, B. (1999) Advances in protein solubilisation for two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis 20, 660-663.
10 . Colas des Francs, C., Thiellement, H., and de Vienne, D. (1985) Analysis of leafproteins by two-dimensional gel electrophoresis: protease action as exemplifiedby ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase degradation and procedure toavoid proteolysis during extraction. Plant Physiol. 78, 178-182.
