大鼠嗅球成鞘细胞分离培养方法

1. 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

出生7-9d大鼠幼仔、手术器械、DMEM培养基和胎牛血清FBS、0.125%胰蛋白酶、PBS等包被：Poly-L-Lysine多聚赖氨酸，储存液浓度为4mg/ml，超纯水稀释（1:300）。使用时浓度为13.3ug/ml。24孔板每孔加50ul室温孵育1h后吸去，超纯水清洗后吹干。

DMEM培养基10ml，添加剂：谷氨酰胺(146.15)2mmol/L 0.3mg/ml ，牛胰岛素 10ug/ml ，人转铁蛋白 100ug/ml， 硒(172.94) 0.224umol/L，0.04ug/ml 3,3',5-L-三碘甲状腺原氨酸(672.96) 0.49umol/L，0.33ug/ml

1.2 实验方法

1.2.1 脱颈处死大鼠幼仔，固定在手术板上，用75%乙醇喷洒头部皮肤消毒

1.2.2 剪去头部皮肤，然后作环形切口，除去颅盖，在鼻尖处显露脑和两个嗅球

1.2.3 从脑部轻轻取下嗅球，用PBS清洗2~3遍，除去血块和毛细血管等

1.2.4 剪碎组织块,用浓度为0. 125 %的胰蛋白酶37 ℃水浴消化15-20 min

1.2.5终止消化后轻轻吹打嗅球组织，过滤后离心(1000 r/ min ,5 min) 去除上清液,重复1-2次

1.2.6 重悬细胞沉淀，接种到多聚赖氨酸包被过的24孔板种，一只幼仔可接1~2孔，每天换液并观察培养结果

2. 实验结果

接种后观察，细胞密度较高，同时血细胞较多；1 h后细胞开始贴壁，呈球形，难以辨认细胞的形态结构。24h后细胞大多贴壁，未出现形态。两至三天后细胞形态稳定，生长较好，成纤维细胞较少。

3.讨论

接种12 h 后有少量细胞贴壁, 悬浮细胞多见；24 h 后可见贴壁细胞增多，少数细胞变形, 呈长梭形；2 d 后变形细胞多见, 突起延伸变长；另可见极少数胞体大而圆、突起较多但较短的细胞， 确定为神经元。

1周后,细胞形态稳定，主要分为两种：单极或双极细胞 ，胞体类似圆形，突起细长，排列不规则，突起互相交织成网状，这种细胞数量最多；还有一种“煎蛋样”细胞，胞核大，胞质散铺围绕在胞核周围， 边界不规则， 突起不明显，形状很似荷包蛋,故称“煎蛋样”细胞。这种细胞也较常见。这两种细胞常独立成片，少见交叉生长。

神经元胞体大，数量少，容易辨认。另外，还可见扁平长梭形细胞紧密贴壁，片状生长，分裂迅速，此为成纤维细胞，这种细胞在彻底剥离外膜的状况下并不多见。还有一种多突起呈星状的细胞, 为星形胶质细胞, 此类细胞数量极少, 单个出现, 容易辨认。

嗅鞘细胞的纯度随培养时间的延长有所下降, 其最主要的原因是杂细胞的生长及杂质的增多, 主要是成纤维细胞的生长，还有一些胶质细胞。随着培养时间的延长, 残留的部分成纤维细胞迅速增殖，造成污染。且遗留杂质增多，使视野不清，纯度下降。

不同的培养板OECs的形态有所不同，在未经多聚右旋赖氨酸处理的培养皿或培养瓶内培养的嗅鞘细胞，不但细胞增殖能力差，细胞形态与经赖氨酸处理过的培养板培养的细胞形态也有很大差别，细胞突起不能完全伸展，变的粗短，没有明显的细长突起编织成的网状结构。

研究表明，经多聚右旋赖氨酸包被的培养板比多聚左旋赖氨酸处理的培养板更利于嗅鞘细胞的生长。