乳中孕酮的酶联免疫测定

一、实验目的

通过对乳汁中孕酮含量的测定，了解酶联免疫吸附分析法(Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay，ELISA)的基本原理与检测技术。

与RIA法相似，利用被测抗原与酶标记抗原对特异性抗体进行竞争结合，测试(加入的)标记在抗原上的酶催化底物所产生的颜色反应。当特异性抗体量一定时，且小于被测和标记抗原时，未标记抗原浓度越高，标记抗原和抗体的结合就越受到抑制，显色愈浅。显色的深浅与酶量呈正相关，而与样品中抗原含量呈负相关。

以标准抗原不同浓度为横坐标，以比色的光密度值(OD)或相应的结合率(OD/ODo%)为纵坐标，绘制标准曲线。根据被检样品的结合率在标准曲线上可查到相应的含量。

目前人们还可以使一些小分子的类固醇激素（如孕酮）与大的蛋白质分子（如牛血清蛋白）结合，成为完全抗原，并按免疫学原理获得抗体。通过检测酶标记该完全抗原的竞争性结合率，来测定该激素的含量。

二、实验动物

奶牛

三、实验试剂

发情牛鲜奶

试剂配制：

1、孕酮抗血清 用11α-孕酮-牛血清白蛋白(11α-P4-BSA)，免疫兔子所得，效价在1：104以上。

2、标准孕酮 用脱激素奶将标准孕酮稀释为一系列不同的浓度，如0.125,0.25，0.5，1，2，4，8，16 pg·ul-1。

3、酶标孕酮(即孕酮-辣根过氧化物酶结合物(P-HRP)) 由11α-孕酮-半琥珀酸(11α-P-HS)和辣根过氧化物酶(HRP)，通过共价键连结而成，稀释度大于1：106以上。

4、包被缓冲液(pH 9.6，0.05 mo1·L-1碳酸缓冲液)，用于稀释抗血清。

Na2CO3 1.59 g ； NaHCO3 2.93 g

NaN3 0.2 g ； 溶于1000 m1蒸馏水中。

5、测定缓冲液(pH7.0，0.1 mo1·L-1磷酸缓冲液，其中含0.87％NaCl和0.1％牛血清蛋白(BSA) 用于酶标抗原及样品的稀释。

Na2HP0·12H2O 21.85 g， NaCl 8.70 g

NaH2P04·2H 2O 6.08 g， BSA 1.00 g

溶于1000 m1蒸馏水中。

6、底物缓冲液(pH 5.4磷酸盐-柠檬酸缓冲液) 用于底物液的配制。

柠檬酸(C6H8O7·H2O) 0.47 g, Na2HP04·12H2O 2.00 g

溶于100 m1蒸馏水中。

7、底物 用于显色。

取10 mg·m1-1四甲基联苯胺硫酸盐(TMBS)或二甲亚矾液(DMSO) 0.2 ml，加入底物缓冲液至5 ml，使用前加50 ul 0.6％的H202。

8、终止液(2 mol·L-1H2SO4溶液) 用于终止显色反应。

浓H2SO4 1份， 蒸馏水 9份。

9、冲洗液(含0.0 5％吐温(Tween)20，pH 7.4的磷酸缓冲液) 用于冲洗酶标板。

Na2HP04·12H20 2.9 g， KH2PO4 0.2 g

NaCl 8.0 g， KCl 0.2 g

Tween20 0.5 m1 溶于1000 ml蒸馏水中。

10、脱激素(孕酮)奶(发情牛奶通过由葡聚糖凝胶包被的活性炭吸附而得)

以5.0 g活性炭和0.5 g葡聚糖(G25)溶于250 m1不含BSA的测定缓冲液，磁力搅拌器搅拌30 min，成为用葡聚糖包被的活性炭(DCC)。取DCC一份，加等量奶样,3000 r·min-1离心10 min，取上清液即为脱激素奶。

四、仪器与器材

聚苯乙烯板(酶标板)，酶标测定仪，试剂瓶，微量加样器及塑料吸头(50 ul，200 ul，1000 ul)，恒温水浴锅，水箱，磁力搅拌器。

五、实验方法和步骤

1、酶标板的预处理 新制的酶标板含有有机成分，使用前先用无水乙醇浸泡二小时以上，再用蒸馏水冲洗干净，37℃烘干或阴干。

2、制作孕酮抗血清稀释度曲线及选择孕酮抗血清工作浓度 将孕酮抗血清稀释成不同浓度，包被同一酶标板的不同孔眼后,测其光密度,其目的选择最适抗血清稀释工作浓度。随着抗血清浓度的下降，光密度也随之下降，一般初选光密度值为1.0左右时的稀释度为孕酮抗血清的工作浓度(图13.7-1)。

3、制作酶标孕酮稀释曲线及选择酶标孕酮工作浓度 以初选的抗血清稀释度包被酶标板，将酶标孕酮稀释成不同浓度，绘出酶标孕酮稀释曲线(见图13.7-2)，选择斜率最大并有一定光密度值的稀释度为工作浓度。

4、酶联免疫分析的操作步骤 （按表13.7-1程序进行）

(1)加孕酮抗体 酶标板第一纵列为空白,加包被液200μl作为参比孔，其他各列均加最适稀释度的孕酮抗血清200 u1稀释好的抗血清，置4℃冰箱过夜。

(2)冲洗未吸附的游离抗体 取出包被28 h以上的酶标板。吸去孔内液体，用冲洗缓冲液洗三次，吸干。

(3)加待检奶样或标准孕酮 在空白孔和0标准孔中加100 ul去激素（孕酮）奶；其它标准孔中，每孔加100 ul标准孕酮；样品孔中加5倍稀释的脱脂奶样100 ul。每个样品至少有二个重复。

(4)加酶标孕酮 每孔加以所选最适稀释浓度的酶标孕酮100 u1。

(5)温育酶标准板置37℃恒温箱3 h。

(6)冲洗未结合的孕酮， 同(2)。

(7)显色反应 每孔加200 ul新鲜配制的底物液，室温放置45～60 min，或37℃30 min，让其充分显色。

(8)终止反应 每孔加50 ul 2 mol·L-1H2SO4,终止酶促反应。

(9)检测 用酶标测定仪检测波长450 nm处的光密度值(OD450)。

5、计算

测得样品的OD值或结合率(占0管OD值的百分比)，可从标准曲线上直接查到相的孕酮含量。

6、注意事项

(1)用于包被的抗血清浓浓度必须合适，过高就不存在结合的竞争性。

(2)奶样中含有对测定的干扰物，因此标准品用脱激素奶样稀释，可以校正非特异性。

(3)免疫反应温度不能超过40℃，不利于抗原抗体结合物的生成，且易使酶和抗血清的活性降低。一般37℃温育3 h，38℃温育2.5 h。

(4)所用微量加样器，要求吸样准确，应进行检查校正。

六、实验结果

绘制标准曲线图，并报告样品测定结果。