脐静脉内皮细胞培养

准备的药品：pbs,199培养液，I型胶原酶（SIGMA）。

主要的器械：手术剪，镊子，止血钳，丝线，鞘管（PTCA用的动脉鞘的扩张管，6F或7F）。

首先，以PBS漂洗脐带1-2次，用剪刀将脐带剪成数段15CM左右长短（本人认为这个长度较为合适）。

之后，以止血钳提起一段脐带的一端，将鞘管插入脐静脉中，并经该鞘向静脉内注入PBS10-8ml左右（最后注入空气吹净残留液体），后以丝线将另一端结扎（一定要扎紧），并从鞘管注入适量胶原酶，一般1ml（0.1%）足以,并以止血钳将该端钳闭。后将如此处理的脐带放入小烧杯中，在温箱中孵育10-15分钟（视酶的活力而定）。

最后将消化后的脐带轻轻揉捏2-3次，将结扎线及止血钳除去，后经鞘管向内注入199培养液（8-10ml就可以了，一次即可），将冲刷下来的酶液收集到离心管中，1000rpm离心5-6分钟，后倾去培养液，加入事先配制好的内衣细胞培养液（199，20%FBS,双抗,内皮细胞生长因子），吹打数次制成细胞悬液，接种入培养瓶。

一般一段脐带所得细胞放入一个25CM培养瓶（最好是一次性的塑料瓶）。

注意：

1、如果培养瓶内有较多残血，先不要紧张，因为这样并不影响内皮的生长，第二天予换液一次即可。

2、一定要确保有足够数量的内膜消化下来，否则细胞生长缓慢影响质量（如离心后，管底的白膜-消化下来的内膜较少，必要时可两段脐带合为一瓶）。