分子诊断实验方法

生物大分子主要指核酸(DNA和RNA)和蛋白质，通过从分子水平上完成DNA, RNA或蛋白质检测，从而对疾病作出诊断的方法称为分子诊断，目前常用的方法有基因诊断和肿瘤标志物检测两种。

基因诊断

基因诊断是用分子生物学的理论和技术，通过直接探查基因的存在状态或缺陷，从基因结构、定位、复制、转录或翻译水平分析基因的功能，从而对人体状态与疾病做出诊断的方法。

人体基因组的类型早在受精卵开始时就已形成，因此在人体发育的任何时期，只要获得受检者的基因组DNA，应用恰当的DNA分析技术，便能鉴定出缺陷的基因，而不论该基因产物是否已经表达。

而且，应用这一方法，不仅能够检测单个碱基置换、缺失和插入等，还能发现DNA的多态现象以及遗传病的异质性。基因诊断检测的目标分子是DNA或RNA，反映基因的结构和功能。检测的基因有内源性(即机体自身的基因)和外源性(如病毒、细菌等)两种，前者用于诊断基因有无病变，后者用于诊断有无病原体感染。

基因诊断的意义在于不仅能对某些疾病做出确切诊断，如确定某些遗传病，也能确定基因与疾病有关联的状态，如对疾病的易感性、发病类型和阶段的确定等。

就目前已经开展的工作而言，外科领域的遗传性疾病、遗传易感性疾病、多种恶性肿瘤、感染性疾病、器官移植反应等都可以用基因诊断的方法加以诊断。

基因诊断的主要技术有核酸分子杂交、聚合酶链反应和生物芯片技术。

1．核酸分子杂交技术

1）原理：

具有一定互补序列和核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程，称为核酸分子杂交。杂交的双方是待测核酸序列和探针序列。应用该技术可对特定DNA或RNA序列进行定性或定量检测。

2）基因探针及其标记：

基因探针是一段与待测DNA或RNA互补的核苷酸序列，可以是DNA或RNA，长度不一，可为完整基因，也可为其中一部分。根据探针的来源和性质分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工合成的寡核苷酸探针。

作为探针至少必须满足两个条件，一是应为单链(或通过变性形成单链)，二是应带有可被示踪和检测的标记。有了合适的探针，就有可能检测出目的基因，观察有无突变，也可根据探针的结合量进行定量检测。在与DNA样本杂交过程中，借助上述标记物可探察出特异性或差异性DNA。

双链DNA的变性和复性特点是本技术的基础。经加热，或在强酸、强碱作用下，双链DNA氢键被破坏，双股链分离，变成单链（此即变性）；而当条件缓慢变为中性或温度下降（50oC左右）时，氢键恢复，分开的两股单链又重新合为互补的双链结构（此即复性）。

DNA探针分子杂交就是将样本DNA分子经上述条件处理后，使其变性为单链状态，固定在载体硝酸纤维膜上，再与经小分子标记的DNA探针单链分子混合，在一定条件下使它们互补杂交结合。将未杂交的成分洗脱后，标记物显色，即可观察结果。

选择探针最基本的原则是要有高度特异性，其次也需考虑到制备探针的难易性和检测手段的灵敏性等其他因素。

目前，DNA探针已用于疟原虫、隐孢子虫、贾第虫、锥虫、巴贝斯虫、弓形虫、丝虫、血吸虫、棘球蚴、猪带绦虫、肝片吸虫和猪囊虫等虫种的鉴定和相应疾病的诊断上。

3）常用核酸分子杂交技术：①Southern印迹杂交；②Northern印迹杂交；③斑点杂交( dotblotting)；④原位杂交(in situ hybridization)；⑤夹心杂交(三明治杂交)；⑥液相杂交。

2．聚合酶链反应(即polymerase chain reaction，PCR)

PCR是在引物介导下特异性扩增DNA的技术。它包括模板DNA热变性解链—引物与模板DNA退火—引物延伸3个步骤的循环过程。

其基本原理是在实验条件下，根据温度的变化控制DNA解链和退火（引物与模板DNA结合），在引物启动和DNA聚合酶催化下，合成二引物特定区域内的DNA链。上述“解链—退火—延伸”3个连续步骤为一个循环。经过20 ～ 30个循环反应，可使引物特定区段的DNA量增加至少105倍。

1）原理：

PCR是模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP )在DNA聚合酶作用下发生酶促聚合反应，扩增出所需目的DNA。包括三个基本步骤：双链DNA模板加热变性成单链(变性)；在低温下引物与单链DNA互补配对(退火)；在适宜温度下TapDNA聚合酶催化引物沿着模板DNA延伸。

2）PCR引物：

PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性，引物设计决定PCR反应的成败。由于致病基因是在正常基因序列中发生点突变、片段插人和(或)缺失，基因两翼的DNA序列和正常基因仍然相同，因此根据基因两翼的DNA序列可设计出各20个碱基左右的一对引物。

3）常用PCR技术：

利用PCR技术，在适当条件下扩增目的基因，然后分析PCR产物，便可判断其是否为致病基因及其变异性质。此外，PCR具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速、样品处理简单等优点。

反应过程可在PCR仪内自动进行，根据需要目前已衍行和发展出以下方法：①常规PCR；②复合PCR；③反转录PCR (RT-PCR)；④原位PCR；⑤反向PCR；⑥膜结合PCR；⑦彩色PCR；⑧定量PCR；⑨固着PCR；⑩免疫PCR。

目前，PCR技术多用于寄生虫病的基因诊断，分子流行病学研究和种株鉴定、分析等领域。已应用的虫种包括利什曼原虫、疟原虫、弓形虫、卡氏肺孢子虫、阿米巴、巴贝氏虫、旋毛虫、锥虫、隐孢子虫、贾第虫、猪带绦虫和丝虫等。

3．生物芯片技术

生物芯片技术是近年发展起来的分子生物学与微电子技术相结合的核酸分析检测技术。最初的生物芯片技术主要目标是用于DNA序列测定、基因表达谱鉴定和基因突变体检测和分析，所以又称为DNA芯片或基因芯片技术。

由于目前这一技术已扩展至免疫反应、受体结合等非核酸领域，出现了蛋白质芯片、免疫芯片、细胞芯片、组织芯片等，所以改称生物芯片技术更符合发展趋势。