B淋巴细胞膜表面免疫球蛋白(SmIg)的检查 直接免疫荧光法
丁香园
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一、实验原理
SmIg是B细胞的抗原识别受体,也是B细胞特异的表面标志,用直接免疫荧光法可检查出SmIg。用荧光素标记的抗Ig抗体,在一定条件下与淋巴细胞混合,荧光素标记的抗Ig抗体可以与B细胞表面的Ig结合,在荧光显微镜下观察可见B细胞膜上出现荧光。此方法可用来鉴定B淋巴细胞。
二、实验材料
1. ICR小鼠(北京大学医学部实验动物中心提供)
2. 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗小鼠Ig抗体(购自BD公司)
3. Hank's液:pH7.4(内含0.1%NaN3)
4. 台式离心机
5. 离心管、吸管、移液管等
三、实验方法
1.采用颈椎脱臼法处死小鼠,解剖取出脾脏放入盛有6ml Hank's液的平皿中,用100目钢网研磨,混匀。从中吸取1ml细胞悬液放入一试管中,加满Hank's液,离心1000rpm,10分钟,洗涤细胞一遍。倾去上清,沉积的细胞恢复1ml
容积,即为约1×10/ml的细胞悬液。另取一支试管,吸取1×107/ml的细胞悬液0.4ml加Hank's液3.6ml,即为1×106/ml的细胞悬液。
2.取2ml离心管两只,各加入1×106/ml的细胞悬液1ml,用台式离心机离心2000rpm,3分钟,弃去上清液。一支加入荧光素标记的兔抗鼠Ig抗体100µl,另一支不加抗体作对照,置4℃冰箱30分钟。
3.取出离心管,用Hank's液洗涤细胞两次,以去除游离的抗体,最后一次离心后弃去上清液,留少许回流液,混匀,滴片,用荧光显微镜观察。
四、实验结果
荧光显微镜观察,落射激发光下SmIg阳性细胞可见环状或斑点状荧光。用钨丝灯光源透射光照明计数同一视野内淋巴细胞总数,共计数200~300个淋巴细胞,算出其中SmIg阳性细胞的百分数。
五、注意事项
在滴片前要彻底去除游离的抗体,以避免假阳性结果。