【求助】请教荧光素酶报告基因检测NF-KB转录活性需要哪些试剂？

丁香园论坛2015-08-21

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阿兰梦

之前没有做过，只是根据文献的简单描述依葫芦画瓢，但是毕竟是好几千的试剂，生怕弄错了

临床医生一下子做科研，确实很多地方不懂，很艰难

目的是想用双荧光素酶报告基因的方法检测药物内皮细胞的NF-KB的转录活性影响，需要买pNF-kB-Luc 报告质粒，碧云天有；然后需要双荧光素酶报告基因检测系统，promega有；另外还需要一个内参，文献是β-半乳糖苷酶

问题是：

1、不知道买哪一个对：

http://www.promega.com.cn/Product.asp?PostType=List&Pro_Class=133

是pSV-β- 半乳糖苷酶对照载体还是Beta-Glo检测系统？

最后的结果处理，是目的基因的结果除以内参基因吗？即：（目的基因萤火虫/目的基因海肾）÷（内参基因萤火虫/内参海肾）

2、需要买转染试剂。那么怎么判断它的转染效率？只有看荧光素酶的荧光强弱来判断吗？

阿兰梦

很迷惑，难道是传统的测β- 半乳糖苷酶作为内参，用单荧光素酶报告基因检测目的基因？

现在有了双荧光素报告基因，就不用这样了？就可以光用海肾荧光做内参了？

erik

恩，内参为pRL-TK。看看这个合适不?

http://www.promega.com.cn/Product.asp?Pro_ID=899&PostType=Detail

阿兰梦

研究了半天加一晚上，明白了一点点了：

1、要么是用双荧光素酶报告基因系统，要么是用单荧光素酶报告NF-KB基因，加上一个内参基因如半乳糖苷酶。

我之前的理解错了，以为双荧光素酶加上半乳糖苷酶都要检测，以为前者是荧光的对照，加上后者是基因活性的对照。

2、关于内参基因的选择，TK的要比含有SV的弱些，做的时候要摸索目的基因和内参的荧光强度比例，因各不同细胞而异。

我再继续看看有关东西，谢谢楼上啊

阿兰梦

质粒拿到手该怎么办？扩增再抽提？

怎样判断转染效率？

没想到会有这么多的事

zhuqueleee

1，质粒扩增就是转化一下再试剂盒抽提即可

2，判断转染效率可以选用一个带GFP的质粒试一下，另外常用细胞系和转染试剂的转染效率一般都可以查到

3，单报告双报告都可以，只是双报告的简单一些，不要数细胞

4，碧云天的的的，的pNF-kB-Luc 报告质粒有效性本人持保留意见，因为我们原来买过，但是好像不行！

个人意见，仅供参考！

天飒

我也想知道这个怎么做的关于双报告基因实在有点困惑，麻烦了解的介绍一下！谢谢啦！

天飒

版主，我想了解下你们做的关于双报告基因在NF-kB上的实验，有点不懂，特别是双报告基因
谢谢了！

lijing11999

zhuqueleee wrote:
1，质粒扩增就是转化一下再试剂盒抽提即可

2，判断转染效率可以选用一个带GFP的质粒试一下，另外常用细胞系和转染试剂的转染效率一般都可以查到

3，单报告双报告都可以，只是双报告的简单一些，不要数细胞

4，碧云天的的的，的pNF-kB-Luc 报告质粒有效性本人持保留意见，因为我们原来买过，但是好像不行！

个人意见，仅供参考！

我也要做NF-kb的荧光素酶报告基因，请问
1、判断转染效率的时候，我们前期已经摸索成熟一个转染试剂的转染条件，是不是能直接用；
2、对照组是转染空质粒还是内参基因
3、你既然做过，能不能提供pNF-kB-Luc 报告质粒，我没做过这部分研究，所以没有质粒可以交换，只能买了
联系方式lijing11999@126.com

sh基因多态性

透射电镜观察细胞自噬，扣扣 2441149844

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