凋亡和细胞周期调控相关基因的应用

前言

通过引入小干扰RNA（siRNA），靶向基因抑制的系统性高通量功能性基因组筛选表现为一种生物学功能分析的极有效方法。 这种筛选通常产生大量的“阳性”，即在所研究的特殊生物学功能中可能起作用的基因。

但是，区别真假阳性以及仔细评估基因在所分析条件下的作用机制却很困难。这些分析经常用细胞凋亡或细胞周期中的变化作为表型/功能的检测结果。但是，这些重要细胞代谢过程中的变化可以由许多不同途径所引起。为了更深入地了解基因抑制如何导致细胞凋亡或细胞周期方面的变化，对这些过程相关其他基因表达的分析非常有用，因为这有可能阐明有关的途径，并确定功能基因网络。

我们在HLR-CHOP细胞中进行siRNA筛选，以确定控制细胞周期调控和凋亡的基因。在两种筛选中，通过转染siRNA而下调基因，在细胞周期分析中在7-AAD染色后用流式细胞术分析对DNA内容的影响，在凋亡分析中分析对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3激活的影响。

在细胞周期分析中，通过RNAi对DONSON和GDF3的下调导致细胞周期G1期的阻断。为了描述这两个基因在细胞周期调控中的进一步作用，我们在抑制DONSON和GDF3基因后用qRTPCR分析了一组91个内源性表达的细胞周期基因。为此我们使用LightCycler® 480实时荧光定量PCR仪和RealTime ready细胞周期检测预制多孔板。用特异抗体和流式细胞术测定天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的激活。

在这个分析中，我们发现C24ORF17和BARD1基因下调后，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的激活增加了。为了确定编码蛋白在凋亡诱导中的作用，在本研究中我们使用RealTime ready凋亡检测预制多孔板和LightCycler® 480仪器，通过qRT-PCR分析了当通过RNAi而表达量下调时，C24ORF17和BARD1对凋亡调控有关的一组378个基因的影响。

进一步试验了已经在细胞周期检测预制多孔板中分析过的DONSON和GDF3基因对19个管家基因的RealTime ready参照基因检测板的潜在影响，然后利用对于管家基因的分析结果进行实验数据的标准归一化。 此外，对所有检测板，在所分析基因在转染siRNA后的内源性表达方面的变化与作为对照的转染siRNA靶向GFP的HeLa细胞中的表达进行比较。

材料和方法

细胞培养

HLR-CHOP细胞（Stratagene）在37℃ ，5% CO2条件下，保存于加有1%左旋谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素、 10% FBS（GIBCO-BRL）、潮霉素（100μg/ml）和G418（geneticin，250μg/ml）的DMEM（GIBCO-BRL）中。 用40 nM siRNA转染细胞，转染48小时后，用TNF-α（33 ng/ml）刺激细胞。

RNA分离和逆转录

用RNeasy试剂盒在两个独立反应（每个siRNA 2个生物学重复）中从1×107 HLR-CHOP细胞提取总RNA。

每次用700 ng总RNA，以及根据厂家指导手册采用寡脱氧胸腺核苷酸（dT）18和随机六聚体引物的混合物的Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒，在独立反应中进行第一链cDNA合成。

qRT-PCR

以20μl反应量、96孔格式和10μl反应量、384孔格式，用LightCycler®480仪器和2× LightCycler®480 Probes Master，用RealTime ready分析方法进行qRT-PCR。在96孔格式中采用每次反应10 ng的cDNA/RNA浓度，在384孔格式中采用每次反应4 ng的浓度。LightCycler?480的反应条件设置为：95℃ 10分钟；95℃ 10秒钟，45个周期；60℃ 30秒钟；72℃ 1秒钟；然后是40℃ 30秒钟的最终冷却。

结果和讨论

首先，我们检测了在HLR-CHOP细胞中抑制GDF3和DONSON基因对19个管家基因表达的影响。 然后将表达结果与细胞转染对照siRNA靶向GFP后的管家基因表达相比。果然，GDF3的抑制或与siRNA靶向GFP处理的细胞相比对许多管家基因的表达无显着影响（图1）。但是，一些管家基因的表达，如β球蛋白，受到这种抑制的强烈调控。这显示了实验中在用管家基因标准化前对哪些管家基因会受到这种基因抑制的影响进行分析非常重要。因此，我们总是对RealTime ready Focus板上提供的所有参照基因的平均值进行标准化。

图1: 管家基因表达水平的变化。 显示参照基因板检测所选管家基因表达的倍数变化。

为了验证结果的可重复性，我们分析了所有三个RealTime ready Focus板（凋亡、细胞周期和管家基因）的定量结果，比较来自两个生物学复本的数据。所有三个试验板中都观察到第一和第二个复本之间近乎完全的相关性（图2）。其次，我们分析了两种生物学复本在不同表达水平范围的表达稳定性。 这测定了该分析在不同表达水平的差异。为此，用管家基因板以及参照样品（siGFP处理的细胞）对（每个用siRNAs靶向BARD1、C19ORF24、GDF3或DONSON处理的样品的）两个复本进行标准化，以推导出各自的相对表达水平（图3）。在全部3个板之间进行分析（体现全部947次重复测定）。这些结果显示了变异系数在0.1-2.5倍表达的范围内非常稳定，大约为10%。

图2: 两个生物学重复之间的相关性。 该描记图显示（a）参照基因检测板，（b）细胞周期检测预制板，（c）凋亡检测预制板中每个样品的第一和第二复本之间的相关性。

图3: 生物学重复在不同表达水平的差异。 该描记图说明了所测定的相对表达水平在两个复本之间的稳定性（以变异系数，CV形式表示），以及差异在何范围内稳定。 相对表达水平I通过I= C×2- Ct来计算，这里Ct是循环周期数，C是在此情况下定位1的恒量。 两个生物学复本的Ct值通过管家基因板和参照样品进行标准化，用ddCt法推导相对表达水平。 除了参照样品和管家基因的样品-检测品配对以外，我们还采集了1432个相对表达水平及其标准差，来画出这个带宽描记图。 这1432个按其相对表达水平值分为18个亚组（在X轴上，从0.1到2.6，每组相对表达水平范围以0.1或0.5增加；，0.1' 代表[0.1， 0.2]，，0.2' 代表[0.2， 0.3]，以此类推），每个亚组的变异系数显示于条框中。 该描记图显示0.1到2.6的相对表达水平具有稳定的变异系数，其中位数大约为10%。

我们然后定量分析了转染具有siRNA靶向GDF3或DONSON的HLR-CHOP细胞后，在细胞周期检测板中94个基因的表达，并将结果数据与从转染对照siGFP的细胞获得的数据进行比较。

针对GDF3和DONSON的siRNA都显示在7-AAD细胞周期分析中的作用。 因此，我们期待在细胞周期检测板中分析的一些基因中也观察到表达的变化。 实际上，在将转染siRNA靶向GDF3和DONSON的细胞与转染siGFP的对照细胞相比时，我们发现了25个显示大于50%表达差异的基因（图4）。 在细胞周期检测预制板上的94个基因中，当与siGFP处理的对照细胞相比时，周期素D2在GDF3和DONSON处理的细胞中分别下调70%和85%（图4）。 周期素E2只在siRNA靶向DONSON处理的细胞中下调80%。 在GDF3转染的细胞中，周期素E2只有轻微改变。 如果我们对在相同样品中上调的基因进行分析，那么在两个样品中上调最强烈的是p21，也被称为周期素依赖的激酶抑制剂1a。 当与转染siGFP的对照细胞相比时，p21在GDF3和DONSON siRNA转染细胞中分别上调1.81-3.31倍（图4）。

图4:细胞周期基因表达水平的变化。显示了在RealTime ready细胞周期检测预制板中检测的所选基因表达水平（周期素和周期素依赖的激酶）。

这样，GDF3和DONSON的抑制引起周期素D2下调和p21上调。 已知周期素D2与CDK4或CDK6的调节亚基形成复合物（1）。 细胞周期G1/S的转换需要这种复合物的这种活性[1]。 此外，已经描述过p21的诱导主要引起细胞周期停滞，而p21能稳定cdk4/cdk6和D周期素之间的相互作用，从而促进负向调节细胞周期进程的活性复合物形成[2]。 这样，GDF3和DONSON的抑制引起p21上调和周期素D2下调，解释了G1期中的停滞。

对于在下调时引起天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3激活的C24ORF17和BARD1，我们检测了RealTime ready凋亡检测预制板上的378个基因。 与siGFP处理的对照细胞相比，125个被分析基因在用任何一个siRNA处理后都显示大于50%表达水平的改变。 有意思的是，两种基因的抑制引起许多相似的作用，但我们也观察到对上调或下调基因的一些清晰差异。 例如，与siGFP处理的对照细胞相比，在转染siRNAs靶向C24ORF17或BARD1的样品中，IL-10、BIRC8、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶10显示强烈的下调，而TIMP3、ATF5、BAG3和BTK显示显着上调（图5）。 编码TNFRSF11B的其他mRNA只在转染siC24ORF19的细胞中显示强烈上调，在siBARD1转染细胞中无上调，而IL-18显示只在siBARD1转染细胞中显着上调，在siC24ORF19转染细胞中无上调。 相反，CD38显示只在siBARD1转染细胞中强烈下调，而DAPK1显示在转染siRNA靶向C24ORF17的细胞中强烈下调，在转染siRNA靶向BARD1的细胞中微弱下调。

图5:凋亡基因表达水平的变化。显示了在凋亡检测板中检测的所选基因表达水平。

总之，对于在凋亡检测板中试验的两种基因，发现了受影响基因的不同类型。 这些基因的上调和下调对凋亡的相关性有待阐明。

结论

全部3个RealTime ready Focus检测预制板（参照基因、细胞周期调控、凋亡）在不同表达范围的可重复性方面都运行良好。 在全部生物学复本的98%以及全部板中，测定的Ct值几乎相同。我们的实验显示这些板对于细胞周期和凋亡相关基因以及管家基因表达的定量分析是有效的工具。由于在凋亡和细胞周期板上可用作内部对照的不同管家基因，对两个样品之间的表达差异进行标准化是非常容易做到的。在关于在特殊样品中改变了的凋亡和细胞周期相关基因表达方面，凋亡和细胞周期板提供了具有丰富信息的可靠数据。这有助于理解所分析的条件如何引起对细胞周期或凋亡的影响。