review of DNA methylation

DNA 异常甲基化与肿瘤临床
张吉才编译
DNA甲基化是一种常见的人类DNA修饰,它是在DNA甲基转移酶（DNMT）催化下将甲基加到CG二核苷酸的C上形成的。因甲基化改变只影响DNA的结构，而不影响遗传编码，它被视为一种外遗传变化，而不是遗传变化。由于人基因组能通过脱氨作用将mC变为T，人基因组有较高清除CG二核苷酸的能力。但人基因组内仍有少量的区域富含CG二核苷酸，长度可达若干kb，这些区域称CPG岛。其它区域内的CPG二核苷酸是高度甲基化的，不同的是，成人组织内CPG岛通常是处于未甲基化状态，这种甲基化方式具可遗传性。整个基因约有30，000个CPG岛，其中50~60%与基因有关，分布于促进子（promoter）内。研究证明：促进区内CPG岛的甲基化与基因的转录抑制有关。
DNA甲基化对发育是非常重要的。三种DNA甲基化转移酶(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B）的任一纯合性丢失可导致小鼠的死亡，提示DNA甲基化对基因的正确表达是非常重要。但成年组织对甲基化的依赖程度较低，其作用可能是维持大量非编码区处于失活状态，以保证转录因子(TF)与其靶位点特异结合。CPG岛甲基化作为一种控制成年组织特异基因表达机制，主要见于两类基因：1、X染色体的失活与其大量甲基化有关；2、与印迹（imprinted)基因的表达有关。在印迹基因内只有一个等位基因表达，不管是来自母体或父体。非表达等位基因的失活与其促进子内的大量甲基化有关。然而在正常组织内,对大多数与CPG岛有关的基因不论其表达与否，其CPG岛处于未甲基化状态。
这种情形与人肿瘤细胞系形成鲜明的对比,在肿瘤细胞内其CPG岛甲基化非常常见。1990年Bird等研究肿瘤细胞系基因失活常与CPG岛甲基化有关，几乎近所有类型的肿瘤均有甲基化失控。通过对基因组进行广泛DNA甲基化研究显示：肿瘤常表现出整体甲基化水平降低,而CPG岛内甲基化增加。以下对肿瘤的这种甲基化方式的机制、作用及临床应用做一简介。

一、DNA甲基化与基因转录抑制
目前为止,已发现哺乳动物有三种DNMT。第一种是DNMT1，其作用是在细胞分裂过程中维持新合成DNA链的甲基化，对半甲基化DNA有较高活性；另两种甲基化酶（DNMT3A、DNMT3B）对半甲基化DNA无优先性,是全程（de novo）甲基化酶。
甲基化引起的转录抑制机制之一：直接抑制TF的结合。许多TF对其结合位点的甲基化敏感,有些不敏感,更多的TF识别序列内没有CPG位点。通过近年的研究一种更实用的DNA抑制转录的机制突现出来，即DNA甲基化导致新近发现的甲基结合区域（MBD）蛋白家族的结合。这些蛋白共有一个MBD，使它们能够特异结合含CPG位点的DNA。这个家族中至少有三种（MeCP,MBD2,MBD3）与大蛋白分子复合物有关，这种复合物中有组蛋白去乙酰化酶活性(HDAC1和HDAC2)和染色质重定型（remodelling）(Sin3a和mi-2)活性。这两种活性导致致密染色质的形成，而难以转录；其它蛋白的功能尚不清楚。除上述复合物外，MBD还与几种与转录抑制有关的蛋白有一定关系，如c-ski,N-CoR。
二、DNA甲基化与肿瘤形成
（一）、CPG岛的高度甲基化
肿瘤细胞呈现两种绝然相反的甲基化模式：即整体基因组甲基化不足和CPG岛超甲基化。这两种甲基化模式在肿瘤形成中均起重要作用。现对CPG岛内甲基化的研究比较透彻，其在肿瘤形成中的作用也更加明确。
1、候补基因(candidante gene)的分析
1986年首先报道[1]人类肿瘤CPG岛超甲基化，直到1996年[2],基于PCR的甲基化技术的出现，对CPG岛甲基化的研究才开始增多。CPG岛超甲基化在肿瘤形成中的作用可通过许多例子进行说明。其主要是通过外遗传失活方式，而非遗传方式影响基因的表达。典型的例子是GSTP1基因，编码glutathione S-transferase π，此酶与损伤DNA的亲电子剂（electrophile）的脱毒有关。绝大多数（>90%）前列腺癌中失去表达这种蛋白的能力,这种表达丢失几乎全部与GSTP1促进子的超甲基化有关[3，4]。的确，促进子的甲基化和GSTP1的不表达可在大多数癌前前列腺内上皮瘤形成（prostatic intraepithelial neoplasia，PIN）病变中见到[5]，提示它们可能是前列腺癌形成的一个早期事件。GSTP1表达丢失引起脱毒活性下降，导致DNA氧化损伤增加，这可能是大多数前列腺肿瘤形成的启动事件。另一类似例子是MLH1基因（mismatch repair gene,MMR）。
另一个重要的研究显示：在恶性变前的高度增生组织中可见DNA异常甲基化，除GSTP2在PIH中的异常甲基化外，对癌旁组织中关键的肿瘤抑制基因（Rb,p16）的研究也观察到异常DNA超甲基化的存在，提示CpG岛甲基化在肿瘤形成早期起重要作用，可能是启动事件。
虽然导致CpG岛异常甲基化的机制尚不清楚，但有资料显示某些肿瘤存在特异性缺陷，使它们对异常甲基化敏感。Toyota等[6]证实结肠癌中CpG岛高度甲基化在肿瘤之间不是随机分布的，有些对CpG岛甲基化相对抵抗，其它对甲基化有较高的敏感性。

2、CpG岛大规模甲基化分析
至今，几乎所有研究CpG岛甲基化均采用候补基因方法。虽然用此法已发现大量CpG岛甲基化沉默（silencing）的基因，但要搞清肿瘤CpG岛的范围还需要大规模甲基化分析，目前有两种进行此项研究
(1) 差异甲基杂交分析(differential methylation hybridization ,DMH): 由Huang等[7]设计,其原理见图1。该法将甲基化敏感的限制性内切酶消化与芯片技术相结合，可同时筛选几千CpG岛。此法已用乳癌广泛性CpG甲基化分析，作者也证实甲基化的程度或范围与肿瘤分级相关。

(2) RLGS（Restriction landmark genomic scanning）由Costello等[8]报道，该法基于一二维凝胶电泳技术称RLGS，可同时分析不同肿瘤共同的甲基化模式和肿瘤特异性的甲基化。根据他们结果预测人类基因组约有30000个CpG岛，单个肿瘤最多3000个异常甲基化岛，平均400个。除了用于鉴定肿瘤特异性甲基化外，RLGS已用于发现、识别不同肿瘤内DNA甲基化的新靶点。

候补基因分析方法主要集中于分析那些在肿瘤形成过程中其作用已被证实的基因的甲基化状态，与之不同，通过大规模甲基化分析发现的甲基化新靶点其作用尚不明确需要进一步研究。
（二）、基因组整体DNA甲基化不足
发现人肿瘤基因组整体DNA甲基化不足比CpG岛内超甲基化更早，但CpG岛内超甲基化与肿瘤形成相关已得到认同，而基因组整体DNA甲基化不足与肿瘤形成过程中作用尚有许多不明之处。尽管如此，已发现多种肿瘤CpG岛外DNA的广泛去甲基化，人们提出可能通过以下几种机制，基因组整体DNA甲基化不足参与肿瘤形成过程。
1、 染色体稳定性
肿瘤细胞染色体色体异常比较常见，这提示甲基化可能与控制染色体稳定性有关。
2、 逆转座子激活（retrotransposon activation）
人基因组含大量移动遗传组分，称逆转座子。DNA甲基化通常抑制这些组分的表达。
已经发现去甲基化可使这些组分的再激活，引起这些组分的再移动，重新整合到基因组的新位点，引起插入突变。在人肿瘤中可见逆转座子插入引起的突变，但这种突变不常见，它在肿瘤形成中的作用并非十分重要。
3、 癌基因激活
DNA甲基化程度最主要的作用可能是基因，特别是癌基因的激活。已发现H-ras,c-myc基因的甲基化不足，但与表达增加无相关。X染色体上的基因，特别是MAGE家族，促进子进行去甲基化，以肿瘤特异性方式激活，但还没资料证实这些基因在肿瘤形成中起什么作用。尽管如此这也说明去甲基化可导致基因激活。

三、肿瘤特异性甲基化变化机制
（一）DNMT表达增加
虽然CpG岛甲基化在肿瘤中的作用日益明显，但其形成机制仍不清楚。研究最多的可能原因是一种或几种DNMT的表达增加，多数研究认为支持这种说法，但也有不同意见。总之DNMT表达增加对肿瘤异常甲基化中到底起多大作用还不确定。CpG岛超甲基化常与整个基因组甲基化不足相伴随，提示有其它因素对肿瘤的异常甲基化起作用。
（二）p21WAF1的作用
整体基因组甲基化不足和CPG岛超甲基化这种相反变化提示:DNMT的正常靶向控制失调。有资料[9]表明细胞周期素依赖激酶抑制剂p21WAF1在调控DNMT中起一定作用。作者分析了p21WAF1和DNMT1与细胞增殖核抗原（PCNA）同一区域的结合情况。DNMT1与PCNA的结合在细胞周期后S期将DNMT1靶向复制复合物中起重要作用。体外试验显示源于p21WAF1的寡肽能高效抑制DNMT1-PCNA形成[9]。尽管正常结肠上皮细胞中DNMT1和p21WAF的表达互相排斥，但腺息肉（adenomatous polyps）中表达DNMT细胞也表达p21WAF，且p21WAF在乳癌、肺癌、卵巢癌和肝细胞癌的早期阶段高度表达。
p21WAF在肿瘤发生早期高表达，替代DNMT1形成复制复合物，引起基因组甲基化不足，导致游离DNMT1错误靶向CPG岛，反过来，基因组甲基化不足，引起DNMT1表达增加，更增加CPG岛的超甲基化。
（三）甲基化下游因素的参与
DNA甲基化和染色质结构变化之间存在一种环状反馈关系，DNA甲基化使染色质失活，反过来染色质失活导致DNA超甲基化，这提示改变染色质结构的因素也可引起甲基化状态的改变。已知ATRX基因与人ATRX综合征（X连锁的地中海贫血和精神呆滞）有关，ATRX基因的突变可引起整体甲基化的不同程度变化[10]。ATRX蛋白与染色质重定型（remodelling）蛋白同源，特别是Mi-2,在转录过程中可能作为调节染色质结构的调节剂。有趣的是ATRX基因突变引起的甲基化改变包括特定序列的甲基化不足和增加，类似于肿瘤细胞的DNA甲基化模式[10]。这些结果提示甲基化下游诱导转录沉默作用（silencing）的蛋白复合物的改变不仅引起转录改变，而且影响DNA甲基化的改变。

四、DNA甲基化的临床意义和应用
不久的将来，肿瘤DNA甲基化模式在肿瘤病人治疗上越来越重要。国外有几家公司正从事抗DNA甲基化治疗研究，如Epigenx（http://www.epigenx.com）公司,Intergenco(http://www.intergenco.com)公司,已有多个运用抗DNA甲基化的药物的临床试验已经完成或正在进行中。DNA甲基化在肿瘤早期诊断和病人愈后判断方面也有重要的应用价值。
（一）抗DNA甲基化的治疗
DNA甲基化引起大量基因的失活,而在肿瘤发生中起重要作用.因此通过抑制甲基化或重新激活相应的基因,以达到治疗肿瘤的目的,这为肿瘤治疗开辟了一条新的道路。因非癌细胞中这些基因不受DNA甲基化的正常调控，甲基化抑制剂对非癌细胞的毒性比传统抗癌药物疗法小得多，从这方面讲，这种疗法的前景十分诱人，尽管整体甲基化不足也有副作用。
抗DNA甲基化治疗有几个途径：
第一、药物治疗。至今只有几种有效的DNMT抑制剂。如5-氮杂胞苷（5-azacytidine）和2-脱氧-5-氮杂胞苷（亦称decitabine），已用于抑制培养细胞的DNA甲基化，显示能激活被甲基化失活的基因。另decitabine还能诱导细胞分化，用于治疗造血紊乱。但因其毒性，它在重激活被甲基化灭活的基因方面的应用受到一定限制。
组蛋白去乙酰酶活性在甲基化基因的转录抑制也起重要作用。将decitabine与抑制去乙酰化酶抑制剂，trichostatin A,联合治疗能协同增强重激活结肠癌细胞系MLH1和TIMP3基因的表达。
第二种抑制DNA甲基化的方法是用反义寡核苷酸。针对DNMT1mRNA的反义寡核苷酸能降低DNMT1蛋白水平，诱导去甲基化和肿瘤抑制基因p16的再表达，也能抑制小鼠模型肿瘤的生长。这种疗法已进入临床一期试验，显示一定抗肿瘤活性。
同其它新的治疗方法一样，DNA甲基化抑制剂可能直接通过细胞毒性而发挥作用。与传统抗癌方法不同的是，该药物浓度不是在最大耐受剂量时效果最好。因此，与DNA甲基化抑制剂有关的临床试验最重要的因素是如何用分子终点监测DNA甲基化的变化，特别是监测肿瘤DNA中重要的肿瘤抑制基因甲基化的变化。这种要求只有对少数肿瘤可行，如白血病；另外一种方法是监测整个基因组替代组织如淋巴细胞中5甲基胞嘧啶的浓度；第三种方法是检测胎儿血红蛋白的浓度。用DNA甲基化抑制剂治疗时胎儿血红蛋白浓度增加，据此可作为一个候选分子终点监测DNA甲基化抑制剂治疗效果。
(二)DNA甲基化在肿瘤分类和预后判断中的应用。
DNA甲基化另一个应用是根据甲基化状态对肿瘤进行分类。这种分类在判断肿瘤的预后和对治疗的反应中有一定作用。的确，大量研究已证实了肿瘤甲基化和肿瘤的预后存在关联。如DNA修复基因MGMT缺乏的病人生存时间延长;DAP(death-associated protein)基因甲基化肺癌病人生存期缩短[11，12],提示DAP甲基化可能是这些病人独立的预后判断因素。另由于大规模CpG岛分析方法的出现大大提高了根据DNA甲基化状态对肿瘤进行分类的能力，由于这些方法能识别不同肿瘤的甲基化状态，相关分析甲基化与肿瘤分级的关系。可利用这些技术进一步分析基于甲基化的肿瘤分类在预测病人转归和对某种药物的疗效上是否有用。
（三）DNA甲基化与肿瘤早期诊断
CpG岛超甲基化可能是一个非常有前途的肿瘤早期诊断标志。DNA甲基化的三个关键特性使之可能成为最佳的肿瘤标志物。
1、许多肿瘤CpG岛甲基化率非常高，而正常组织中的CpG岛极少或不被甲基化；
2、DNA甲基化通常集中在基因的特定区域，这与遗传变异不同，遗传变异可发生在基因的不同位置
3、甲基化特异性PCR可检测微量标本中异常甲基化状态。
以上三个特性使DNA甲基化可能成为最佳肿瘤标志物。
当然，DNA作为肿瘤标志物也有一定的问题。虽然肿瘤细胞DNA甲基化模式在正常细胞中不出现，但有资料显示有些基因随着年龄增长其促进子甲基化程度增加，如编码Oestrogen,IGF2的基因，但不是所有基因均如此。可选择随年龄变化其甲基化变化程度小或无变化的基因作为肿瘤标志物。

五 展望
在过去的几年里人们对DNA甲基化在肿瘤中的作用的兴趣越来越浓,在此期间DNMT数量从1个增加到3个受甲基化影响的基因呈指数级增长,对DNA甲基化引起转录失活的机制有了一定的了解。尽管有这些进展，但对肿瘤甲基化变化的机制知之甚少，这是未来研究的一个主要和任务。在临床方面针对甲基化的治疗会越来越多；利用DNA甲基化分析对肿瘤进行分类和早期诊断会有一定的进展。