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荧光PCR法检测RNasin性能效果

新景生物

3327

实验目的:对RNasin性能效果进行检测及评估。

实验材料及设备:

模板RNA:大鼠肌肉组织RNA
引物:Rat β-acting:Forward CCCATCTATGAGGGTTACGC
Reverse TTTAATGTCACGCACGATTTC
RNase:50mg/ml(simgen)
RNasin:40U/µl
cDNA第一链合成试剂盒(simgen)、2×SYBR Green PCR mix(simgen)
设备:ABI 7000 荧光PCR仪、普通PCR仪、离心机及移液器
其他耗材:0.6ml离心管,八连排管,RNase-free吸头,一次性手套及防护用品和纸巾。

实验方法:利用逆转录反应将RNA逆转录成cDNA及SYBR Green荧光PCR方法对RNasin产品的性能效果进行检测评估。

实验方案:

编号 RNA量 RNase 量 RNasin量
1 2µg 4ng 0
2 2µg 40ng 80U
3 2µg 4ng 80U
4 2µg 0ng 0

设计思路:

1. 编号1-4为测试同一批RNasin的性能,1号与3号是测试相同RNA量和RNase量,加不加RNasin对cDNA合成的影响,即RNasin抑制RNase的活性效果。

2. 4号是表示在不添加RNase和RNasin时的空白对照。

3. 2号与3号是测试在相同RNA量和RNasin量的条件下,改变RNase的量,RNasin对不同量的RNase的抑制效果有什么变化。

实验步骤:

1.将模板RNA在冰上解冻;5×gDNA Buffer、RNasin、RNA(500ng/ul)、RNase、RNA-Free H2O、5×RT Buffer、RT-Enzyme mix、RT-Primer mix 、2×SYBR Green PCR Mix、引物、在室温(15-25℃)解冻,解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀,简短离心以收集残留在管壁的液体。

注:RNase稀释需在抽风口或远离PCR操作室的实验室。

2. 按照表1的基因组DNA的去除体系配制混合液,彻底混匀。简短离心,并置于42℃,孵育30min,以保证RNase有充分时间去降解RNA。然后置于冰上放置。

表1 gDNA去除反应体系

试剂编号 1 2 3 4
5×gDNA Buffer(µl) 2 2 2 2
RNA(µl)1~K~Htd~M~2~1~0~0~0~Ktd~M~2~1~0~0~0~04~K~Htd~M~2~1~0~0~0~Ktd~M~2~1~0~0~0~04~K~Htd~M~2~1~0~0~0~Ktd~M~2~1~0~0~0~04~K~Htd~M~2~1~0~0~0~Ktd~M~2~1~0~0~0~04~K~Htd~M~2~1~0~0~K~Htr~M~2~1~0~0~Ktr~M~2~1~0~0~0~Ktd~M~2~1~0~0~0~0RNase(ng)2~K~Htd~M~2~1~0~0~0~Ktd~M~2~1~0~0~0~02~K~Htd~M~2~1~0~0~0~Ktd~M~2~1~0~0~0~020~K~Htd~M~2~1~0~0~0~Ktd~M~2~1~0~0~0~02~K~Htd~M~2~1~0~0~0~Ktd~M~2~1~0~0~0~0—
RNasin(µl)3~K~Htd~M~2~1~0~0~0~Ktd~M~2~1~0~0~0~0— 2 2
RNA-Free H2O(µl) 补足到10µl

注:

1. RNA的浓度是500ng/µl,RNA的浓度不能太低,且RNA需在RNase之前添加,否则可能被RNase降解完从而在荧光PCR上反映不出差异。

2. RNase的浓度分别为1ng/µl和10ng/µl,故在加入RNase时均加入2µl,保证不同的量相同体积,以减少误差,在加RNase的时候应尽量在无RNase的环境中添加,以免环境中RNase过多而导致RNA降解严重从而在荧光PCR上反映不出差异。

3. RNasin的浓度为40U/µl,添加RNasin应在加RNA之前添加。

后续cDNA合成步骤参考cDNA第一链合成试剂盒(simgen)说明书操作。所得cDNA稀释5倍,置于冰上备用。

荧光PCR步骤参考2×SYBR Green PCR Mix(simgen)说明书操作。
将稀释好的cDNA模板按照5µl/管加入到荧光PCR反应体系混合液中,进行荧光PCR扩增,观察实验结果。

实验结果:

在加2ng RNase时,加不加RNasin对cDNA的合成是有明显影响的,即3号比1号的CT值要小6个CT,表示它们的起始cDNA浓度相差大概26倍,说明RNasin对RNase的影响是非常大的。

从2号与3号对比,说明在相同量的RNasin下,当RNase的量增加到20ng时,80U RNasin的效果还不足将RNase完全抑制,说明一定量的RNasin只能对一定量的RNase有足够的抑制作用。

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