天然蛋白的免疫共沉淀方法详解

本方法免疫沉淀得到的天然蛋白可用于 western 免疫印迹或是激酶活性分析

所需溶液和试剂

注意：所有溶液用反渗透去离子水（Reverse Osmosis Deionized water, RODI）或相当纯度的水配制。

1. 20 X 磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）: (#9808) 配制 1L 1 X PBS 时，取 50 ml 20 X PBS 用 950 ml RODI 水稀释到 1L，混匀。

2. 10 X 细胞裂解液: (#9803) 配制 1 L 1 X 细胞裂解液时，取 100 ml 细胞裂解液加 950 ml RODI 水稀释到 1L，混匀。

注意：使用前添加 1 mM PMSF。

3. 蓝色上样缓冲液（SDS 上样缓冲液）：（#7722）。 配制新鲜的 3 X 还原性 SDS 上样缓冲液，在 3X SDS 上样缓冲液中加入十分之一的 30X 的还原剂（1.25M）。

4. 蛋白 A 或 G 琼脂糖微球（用于未标记的一抗）：（处理后可以在 4 °C 保存 2 星期）。按照产品说明处理。蛋白 A 用于兔 IgG 抗体的沉淀，蛋白 G 用于小鼠 IgG 抗体的沉淀。

5. 固定有抗生物素蛋白 Streptavidin 的微球（用于生物素标记的抗体）: (#3419) 用前稍加震荡，每个免疫下拉反应用 10 μl。

6. 10X 激酶缓冲液:（#9802）配制 1 ml 1X 激酶缓冲液时，取 100 μl 10 X 激酶缓冲液用 900 μl RODI 水稀释到 1 ml，混匀。

7. ATP (10 mM):（#9804）配制 0.5 ml 200 μM ATP 时，取 10 μl ATP（10 mM）加入到 490 μl 1X 激酶缓冲液中。

Preparing Cell Lysates 细胞裂解物制备

1. 吸去培养基。加入含调节因子的新鲜培养基，处理所需的时间。

2. 在非变性条件下收集细胞，去掉培养基，用冰 PBS 清洗一次。

3. 去掉 PBS，每个板（10 cm）中加 0.5 ml 冰预冷的 1 X 细胞裂解液，在冰上孵育 5 分钟。

4. 将所有细胞刮下，收集到一个离心管中。置于冰上。

5. 冰浴中对样品用超声处理 3 次，每次 5 秒钟。

6. 4 °C，14000 X g 离心 10 分钟。将上清转移到新的离心管中，即为细胞裂解物。如有需要，样品可以保存在 - 80°C。

免疫沉淀

细胞裂解物预处理（对于未标记或生物素标记抗体而言是可选步骤）

1. 取 200 μl 1 mg/ml 的细胞裂解物，在其中加入 10～30 μl 50% 的蛋白 A 或 G 琼脂糖微球浆（用于未标记的一抗）或 10 μl 抗生物素链菌素微球（用于生物素标记的抗体）

2. 4 °C 孵育 30 - 60 分钟。

3. 4 °C 离心 10 分钟。将上清转移到新的管中。

4. 根据所用一抗选择下面合适的操作步骤进行实验。

使用未标记一抗

1. 14,000 X g 离心 1 分钟。取 200 μl 1 mg/ml 的细胞裂解物，加入一抗。在 4 °C 转子上孵育过夜。

2. 加入蛋白 A 或 G 琼脂糖微球（10 - 30 μl 50% 微球浆）。4 °C 转子上孵育 1 - 3 个小时。

3. 4 °C 离心 30 秒。沉淀用 500 μl 1 X 细胞裂解液洗五次。每次洗好后都置于冰上。

4. 取沉淀进行 Western 免疫印迹分析或是激酶活性分析。

使用生物素标记的一抗

1. 14,000 X g 离心 1 分钟。取 200 μl 1 mg/ml 的细胞裂解物，加入生物素标记的一抗。在 4 °C 转子上孵育过夜。

2. 稍加震荡。加入固定化抗生物素链菌素（与微球偶联）（#3419）（10μl）。在 4 °C 转子上孵育 2 小时。

3. 4 °C 离心 30 秒。沉淀用 500 μl 1 X 细胞裂解液洗五次。每次洗好后都置于冰上。

4. 取沉淀进行 Western 免疫印迹分析或是激酶活性分析。

使用固定化抗体（与微球偶联）

1. 14,000 X g 离心 1 分钟。取 200 μl 1 mg/ml 的细胞裂解物，加入固定化抗体 10 μl。在 4 °C 转子上孵育过夜。

2. 4 °C 离心 30 秒。沉淀用 500 μl 1 X 细胞裂解液洗五次。每次洗好后都置于冰上。

3. 取沉淀进行 Western 免疫印迹分析或是激酶活性分析。

样品分析

继续下述任一种操作：

Western 免疫印迹分析

1. 将沉淀用 20 μl 3X SDS 上样缓冲液重悬。震荡后离心 30 秒。

2. 把样品放在 95～100 °C 加热 2 - 5 分钟。14,000 X g 离心 1 分钟。

3. 取样 15 - 30 μl 加到 SDS-PAGE 胶（4～20%）上。

4. Western 免疫印迹分析检测（参考 Western Immunoblotting 方法）。

注意：对于分子量约为 50 kDa 的蛋白，我们推荐使用小鼠抗兔 IgG（轻链特异）（L57A3）mAb #3677 或小鼠抗兔 IgG（构象特异）（L27A9）mAb #3678 作为二抗，以减少变性重链产生的遮蔽作用。对于分子量接近 25 kDa 的蛋白，推荐使用小鼠抗兔 IgG（构象特异）（L27A9）mAb #3678。

激酶活性分析

1. 沉淀用 500 μl 1X 激酶缓冲液清洗 2 次。置于冰上。

2. 将沉淀用添加有 200 μM ATP 和底物的 40 μl 1X 激酶缓冲液重悬沉淀。

3. 30 °C 孵育 30 分钟。

4. 加入 20 μl 3X SDS 上样缓冲液终止反应。震荡后离心 30 秒。

5. 将含有磷酸化底物的上清转移到新的管中。

6. 把样品放在 95～100 °C 加热 2 - 5 分钟。14,000 X g 离心 1 分钟。

7. 取样 15～30 μl 加到 SDS-PAGE 胶（4～20%）上。