高效液相色谱-串联质谱法检测动物源性食品多种兽药残留

随着社会的发展，畜牧业越来越现代化、集约化和规模化。兽药的使用可以降低发病率与死亡率、提高饲料利用率、促生长和改善产品品质，已成为现代畜牧业不可缺少的物质基础。但是，由于不正确的使用和经济利益的驱使，滥用兽药和超标使用兽药的现象普遍存在。

兽药残留是指兽药的原形化合物或其代谢在动物细胞、组织、器官或其他可食性产品（如奶、蛋）的蓄积和存储。兽药残留既包括原药，也包括药物在动物体内的代谢产物。长期食用兽药残留过高的食物会引起人体的多种急慢性中毒作用，诱导耐药菌株产生，引起变态反应以及三致作用致癌、致畸和致突变作用。

为了保障公众健康和安全，人们需要一种可靠、简便、快速的分析方法来检测动物源性食品中兽药残留量。

目前兽药残留的检测方法有很多，包括高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱法（GC-MS）、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）、试剂盒检测法。LC-MS/MS 因其在定量分析中的灵敏度及选择性最高，从而成为目前主要使用的分析方法。动物源性食品种类多样；基质复杂，干扰物多； 待测物浓度低，为减少基质效应，提高检测的准确性，目前样品前处理过程非常复杂，检测时间较长、效率较低。

MicroSep^® DPX Tips 是一种枪头式分散固相微萃取柱，分散的树脂填装于枪头中，通过简单的吸打过程即可完成样品的萃取、净化、富集。此外，MicroSep^® DPX Tips 不仅适用普通移液器实现手动操作，也可与 Hamilton、 Integra、等多个品牌的全自动移液系统兼容，操作简便、省时、适用性强，可同时进行大批量样品的处理。

==== 样品前处理 ====

A) 根据国家标准 GB/T 22286 - 2008、GB/T 22338 - 2008，动物源性食品中 β-受体激动剂与氯霉素的检测需要加入 β-葡萄糖醛酸酶进行水解。

(1) 称取（0.2±0.002）g 搅碎的试样于 2 mL 离心管中，加入 200 µL IMCSzyme^® 快速水解缓冲液（Rapid Hydrolysis Buffer），充分混匀，加入 5 µL IMCSzyme^® β-葡萄糖醛酸酶，轻度涡旋混匀；37℃ 水解 2 小时。

(2) 水解结束后，在待测样品中加入内标工作液，均质 30 s。

(3) 在均质好的样品中加入 1000 µL 乙腈，涡旋振荡 1 分钟，在转速 14000 r/min 离心 20 min，分离上清液至新的离心管中，60 ℃ 氮气吹干。将吹干的残渣用 750 µL 0.2% 甲酸/水溶液溶解，作为待净化液（注：用 pH 试纸检测待净化液的 pH 值，pH < 4）。

B) 若只检测磺胺类或喹诺酮类药物则不需要进行酶水解。

(1) 称取（0.2±0.002）g 搅碎的试样于 2 mL 离心管中，加入 200 µL 水，加入内标工作液，均质 30 s。

(2) 在均质好的样品中加入 1000 µL 乙腈，涡旋振荡 1 分钟，在转速 14000 r/min 离心 20 min，分离上清液至新的离心管中， 60 ℃ 氮气吹干。将吹干的残渣用 750 µL 0.2% 甲酸/水溶液溶解，作为待净化液。

==== 净化 ====

(1) 用移液器拾取 MicroSep- 105 - 1 枪头式分散固相微萃取柱，操作同移液器上普通枪头。

(2) 平衡柱子：依次用 750 µL 甲醇，750 µL 2% 甲酸/水溶液平衡，即反复吸打 100% 甲醇 2 次，完全打出后再反复吸打 2% 甲酸/水溶液 2 次。

(3) 待净化液上柱：将平衡后的柱子浸入样品溶液中，上下吸取、排放待净化液 4 次。

(4) 依次用 750 µL 0.2% 甲酸/水溶液，750 µL 20% 甲醇水溶液及 750 µL 正己烷洗涤柱子。

(5) 用新鲜配制 1500 µL 30% 氨水甲醇溶液进行洗脱。

(6) 洗脱液在 60 ℃ 下氮气吹干，残余物用 0.1% 甲酸-甲醇水溶液（甲醇：水 = 5：95）200 µL 溶解，涡旋混匀，过滤或离心后，供高效液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）测定。

==== MicroSep^® DPX Tips 操作说明 ====

MicroSep^® DPX Tips 特有的枪头式设计简化了实验步骤，节约了试剂及耗材，样品的提取速度与效率取决于样品能否快速充分地与树脂混合，应用多项专利技术的 MicroSep^® DPX Tips 内部装填分散的吸附树脂，当吸入液体时，树脂随溶液湍流与样品快速混合，悬浮的多孔树脂颗粒保证树脂与样品具有更大的接触表面积，相对于其它固相提取产品具有更强的速度与效率优势。

(1) 手动移液枪 + MicroSep^® DPX Tips

为了达到预期效果，形成湍流是关键。在平衡、洗涤、洗脱的过程中，均有吸打操作，这是与常规移液操作有区别的地方。所谓吸打，不仅要吸入液体，在吸入液体之后还要吸入适量气体，所以移液器的量程一定要大于待吸入液体的量，在吸入液体或气体时，要缓慢释放移液器按钮，确保充分混匀。在吸入气体时，可以看见有大量气泡产生，让树脂随溶液湍流与样品充分、快速混合。

(2) 样品净化步骤中说明的「各洗两次」如何操作

「依次用 1 mL 水、2 mL 10% 乙腈水溶液、1 mL 正己烷冲洗柱子（各洗两次）」

是指将结合样品后的 tips 用 1 mL 水吸打两次（即试管中加入 1 mL 水，用 tips 吸打两次），再用 2 mL 10% 乙腈水溶液吸打两次，最后用 1 mL 正己烷吸打两次。

(3) 待检测样品较多时，有没有更好的解决方案？

MicroSep^® DPX Tips 可适配 Hamilton，Integra 等自动移液系统，轻松实现高通量样品制备。（大部分型号的 LC 都有 96 孔板的适配器，可以在 96 孔板中完成样品制备并直接上样 LC，但 GC 一般没有 96 孔板的适配器，所以如果在 96 孔板中完成样品制备后，需有合适方法将样品转移至 GC 的进样瓶中。

推荐方案一：Integra Assist/Assist Plus + 1250 μL MicroSep^® DPX Tips

Integra Assist 可一次处理 1～12 个样品（Assist Plus 可适配可调间距移液枪），界面简单，可通过简单的操作将所需净化处理过程存储为程序方便重复使用。

优点：价格便宜，操作简便，方便样品转移（无论是 LC 还是 GC 都很方便使用）

缺点：处理样品相对较少；板位较少，可能需要人工加各步所需缓冲液

推荐方案二：Integra Viaflo 96 + 1250 μL MicroSep^® DPX Tips

Integra Viaflo 96 微孔板移液器，是一款经济实用型的电动移液系统，主要使用 96 孔板，界面简单，可通过简单的编程将所需净化处理过程存储为程序方便重复使用。

优点：价格适中，操作简便，32 个以下样品可实现全自动处理（视具体实验过程）

缺点：较多样品时，需手动换板；如后端是 GC，则需要 VOYAGER II 辅助完成样品转移。

推荐方案三：Hamilton Microlab^® 液体处理工作站 + 1 mL MicroSep^® DPX Tips

Microlab^® STAR 系列工作站是以液体处理为核心的生物医药实验室自动化操作平台的巅峰之作，拥有多项世界领先水平的专利技术，也是用户定制型自动化实验操作平台，可进行自动的加样、试剂分配、超微量移液，以及与液体处理相关的振荡、孵育等操作。如果整合第三方设备，可将整个实验流程实现全自动化。

Microlab^® NIMBUS 是紧凑而灵活的小型自动化移液系统，它基于 Hamilton 优良的工作站传统，适用于小通量的应用。NIMBUS 高效率的台面设置提高了最快的速度、最高的吸头定位精度以及移液准确性。

优点：功能强大，高通量、实验流程全自动，结合 MicroSep^® DPX Tips 可完美解决食品安全、司法鉴定、药物代谢、医药研发等检测、分析、科研领域的各种样品制备、提纯问题。

缺点：程序编制较复杂

图片来源：微色谱