如何减少免疫组化的背景染色？

我做的是大鼠肾脏 MMP-9 和 PAI-1 的免疫组化染色。MMP-9 为山羊抗鼠的，PAI-1 为兔抗鼠的，均为中山公司产品。选用中山公司相应的二抗试剂盒。反复做了好几批片子可结果总是不尽如人意，背景颜色比较深，难以判断阳性结果。

具体步骤如下：

1、石蜡包埋组织切片 4μm，用的是中山公司的多聚赖氨酸防脱片的玻片，捞片后置 60℃ 烤箱烤片 2-4 小时。

2、半月后，脱蜡水化

3、PBS 液冲洗，3 分钟×3；

4、切片置于 1％triton-x-100 液中 37℃ 温浴 10 分种；

5、PBS 液冲洗，3 分钟×3；

6、每张切片加 1 滴（50?l）过氧化酶阻断溶液，室温孵育 15 分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性；

7、PBS 液冲洗，3 分钟×3；

8、枸橼酸盐修复液冲洗，3 分种×2；

9、微波修复抗原（枸橼酸盐修复液微波高火加热至沸腾，放入切片，中低火维持沸腾 8-10 分种，自然冷却至室温）；

10、PBS 液冲洗，3 分钟×3；

11、滴加 1 滴（50 ul）正常非免疫动物血清，室温孵育 20 分钟（阻滞非特异性染色）；

12、弃去血清，滴加一抗（PBS 液稀释一抗、说明书推荐 1:50-1:500，故取浓度 1:200），置湿盒内 37℃ 孵育 1 小时；

13、PBS 液冲洗，3 分钟×3；

14、滴加 1 滴（50?l）第二抗体，室温下孵育 10 分钟；

15、PBS 冲洗，3 分钟×3；

16、滴加 1 滴（50 ul）链霉菌抗生物素—过氧化物酶溶液，室温下孵育 10 分钟；

17、PBS 冲洗，3 分钟×3；

18、滴加 2 滴（100?l）新鲜配制的 DAB 溶液，显微镜下观察 1-3 分钟，呈棕黄色为止；

19、自来水充分冲洗；

20、苏木素复染 1 分种，自来水充分冲洗；

21、梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

以上过程均保持湿润，每一步都严格按照以上步骤进行。