细胞共定位

实验试剂

高保真聚合酶(pfu ultra)，限制性内切酶(XhoI、SpeI、BamHI、SpeI、SacI)，金粉，无水乙醇，2.5MCaCl₂ ，20ul 0.1M亚精胺

实验设备

PCR扩增仪，PDS-1000/He型基因枪，激光共聚焦显微镜(Carl Zeiss LSM 510 )

实验材料

洋葱

实验步骤

1. 载体的构建

pA7- CFP- AtCOP1，pA7-AtCRY1-YFP

pA7- CFP-OsCOPl，pA7-OsCRY1b-YFP

中间载体pA7-CFP和pA7-YFP为本实验室构建。将AtCOPl(引物为AtCOP1XhoI5' 和AtCOP1 SpeI3')和AtCRYl(引物为AtCRY1XhoI5'和AtCCT1SpeI3')分别用高保真聚合酶(pfu ultra)进行PCR扩增，纯化PCR产物，用XhoI/SpeI双酶切后，分别连接入pA7-CFP和pA7-YFP的多克隆位点上，得到pA7-AtCOP 1-CFP，pA7-AtCRYl-YFP。

将OsCRYlb用高保真聚合酶(pfu ultra)进行PCR扩增(引物为OsCRY 1 bBamHI5'和OsCCTlbSpeI3')，纯化PCR产物，用BamHI/SpeI双酶切后连接入pA7-YFP的多克隆位点中，得到pA7-OsCRYlb-YFP。

将嵌合的OsCOPl用高保真的聚合酶(pfu ultra)进行PCR扩增(引物为AtCOP1XhoI5'和 OsCOP1SacI3')，纯化PCR产物，用XhoI/SacI双酶切后连接入pA7-YFP的多克隆位点SalI/SacI中，得到pA7-OsCOPl-CFP。所有克隆经DNA测序正确后使用。

2. 基因枪操作

1) 微弹制备(金粉母液制备)

a. 称取60mg(或3mg)金粉加入Eppendorf管。

b. 加入1mL(或50uL)无水乙醇，振荡lmin，10,000rpm离心l0s。

c. 弃上清，加入1mL(或50uL)无菌水，振荡lmin，10,000rpm离心l0s。

d. 弃上清，加入1mL(或50uL)无菌水，振荡1 min，-20℃保存。

2) DNA的包裹

a. 取50uL金粉悬液于Eppendorf管。

b. 依次加入5uL质粒DNA (1ug/ul)，50ul 2.5MCaCl₂ 和20ul 0.1M亚精胺(每加完一样，振荡2-3秒)。

c. 振荡3min，10,000rpm离心10-20秒，弃上清。

d. 加250ul无水乙醇，振荡重悬，10,000rpm离心10-20秒，弃上清。

e. 用60ul无水乙醇定容(需重悬)。

3) 基因枪操作

a. 基因枪轰击的前一天将新鲜洋葱的鳞叶切成小块(3-5cm长宽)，置于MS培养基上培养过夜。

b. 轰击之前将洋葱的内表面朝上，用PDS-1000/He型基因枪将上述质粒轰击入洋葱内表皮，黑暗培养24h。

c. 激光共聚焦显微镜观测(Carl Zeiss LSM 510 )。