Visium 空间基因表达解决方案-样本冰冻包埋指南

上海仁科生物科技有限公司2020-07-15

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正所谓“九层之台,起于垒土”，同样，要想拿到优秀的空间转录组实验结果，样本制备也是至关重要的！目前10x Genomics推出的Visium空间基因表达解决方案，支持新鲜/冷冻切片，优化升级后还可以支持FFPE样本，甚至结合免疫荧光染色。今天小编着重为大家介绍一下Visium 空间基因表达解决方案样本冰冻包埋的那些事儿！

Visium 空间基因表达解决方案支持的样本类型

目前，10x Genomics官网已经测试过的组织类型包括：

人类：心脏，肾脏（正常和肾炎），卵巢，乳腺（正常，浸润性导管癌，浸润性小叶癌），淋巴等；
小鼠：心脏，小肠和大肠，胃，肝脏，肾，四头肌，脑，肺，睾丸，甲状腺，胸腺，眼睛，舌头，脾脏等；
大鼠：脑，肾，心脏等

新鲜组织选取和预处理

组织大小：空间转录组Visium芯片的捕获面积为6.5mmX6.5mm，所以在选择样本前，首先确认好最佳的取材位置及合理组织大小，保证Vsium芯片的有效利用率。
组织预处理：新鲜组织样本取下后要迅速用预冷的PBS溶液或生理盐水进行冲洗，去除组织表面残留，然后用干净的吸水纸吸干液体。（此步骤一定要吸干水分，如有液体残留，OCT包埋后，组织表面形成冰晶，影响切片效果）。整个样本处理过程需要保持低温环境。

组织冰冻

在金属烧杯中加入三分之二的异戊烷(使样本足以完全浸入液体中)，然后放入液氮容器(与异戊烷的液面相平)中，使其充分接触，孵育15分钟。同时将所有过程中的采集器具进行预冷。
用预冷的样本匙将新鲜组织浸没在异戊烷中，速冻约1min或直至组织完全冷冻。
采用异戊烷而不是液氮的原因是液氮的沸点低，组织直接放入液氮后会沸腾，在组织周围产生气穴，导致组织降温过程中不同区域降温不同，改变组织内部形态甚至碎裂，影响组织形态。因此该步骤一定要用异戊烷进行冻存，如果没有异戊烷，可以跳过该步骤，直接将新鲜组织进行OCT包埋后速冻。
一旦冷冻，将组织转移到一个预冷的WHEATON CryoELITE低温冷冻瓶中，并放置在干冰上。接下来冷冻组织可放置在-80℃下长期保存或立即进行下一步(冷冻组织包埋)。为了防止组织样本的蒸发和脱水，速冻组织样本必须储存在密封的容器中。

冰冻组织包埋

在冰冻切片之前，冰冻的组织样本会包埋在OCT中。与石蜡或基于树脂的包埋技术不同，OCT不与影响抗原性的蛋白质和其他分子相互作用。OCT组织包埋有以下优点：

保护组织结构，并在冷冻切片时提供结构支持
在切片过程中保持最佳温度，从而使切片光滑
具有水溶性，可以兼容多种染色程序
冰冻组织的包埋前准备：

冰冻组织的包埋具体步骤：

a.取一个适当大小的冷冻模具并做好标记，来标记组织的方向。在加入OCT和组织之前，对冷冻模进行标记。一旦冷冻， OCT很快就会变白，这使得以后很难确定组织的方向性。
b.将冷却后的OCT注入冷冻模具，且不要产生气泡。
c.从-80℃取出冷冻组织，放入干冰中。
d.使用预冷镊子，将冷冻的组织放入OCT，再用OCT覆盖暴露的组织表面。确认没有气泡，特别是在组织附近没有气泡。
e.立即将含有组织和OCT的冷冻模具放在干冰粉上。

f.等到OCT完全冻结。
g.将OCT包埋的组织块储存在-80℃的密封容器中，长期保存或立即进行冷冻切片。可以使用WHEATON CryoELITE低温冷冻管或可重复密封袋来储存组织块。从冷冻模具中取组织块时，可以对组织块进行修剪，使其适合冷冻容器。

样本质检

当我们完成组织冰冻包埋以后，我们需要进行样本组织形态学检测和RNA 完整性检测。

组织形态学检测：冰冻切片，做普通 H&E 染色即可。主要观察组织形态上是否完整，比如是否有大的裂痕、冰晶形成而产生的气泡、褶皱等，在客户可以接受的范围之内。
RNA 完整性检测：收集冰冻切片10~20片，提取 RNA，跑2100检测。RNA RIN 值应大于7，即可进行空间转录组文库的构建。