基因敲除结核杆菌助力研究细胞焦亡的信号通路
上海晶诺生物科技有限公司
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2020 年 10 月 21 日，武汉大学章晓联、殷雷老师作为共同通讯作者在 Science Advances 在线发表研究成果 “Mycobacterial EST12 activates a RACK1–NLRP3–gasdermin D pyroptosis–IL-1β immune pathway”，该研究鉴定了一种从 M. tb H37Rv 分泌的细胞焦亡诱导蛋白 EST12（Rv1579c）。
导读：
细胞焦亡是一种程序性细胞死亡的炎性形式，与消除病原体感染有关。该文章介绍了一种诱导巨噬细胞焦亡的结核蛋白 EST12。EST12 结合巨噬细胞中活化的 C 激酶 1（RACK1）的受体，EST12-RACK1 复合体募集去泛素化酶 UCHL5 来促进 NLRP3 的 K48 连接去泛素化，随后导致 NLRP3–caspase-1/11–GSDMD–IL-1β免疫过程。EST12 晶体结构分析表明，氨基酸 Y80 是 RACK1 的关键结合位点。EST12 敲除菌株在体内或体外 MTB 感染中都显示出了高易感性。该研究首次证明了 RACK1 作为病原体的内源宿主感应蛋白，并且 EST12-RACK1 诱导的细胞焦亡在 M.tb 诱导的免疫中起关键作用。
研究内容：
1、RD 区编码蛋白筛选：对 40 种 RD 区（RD1-3、11-14）重组蛋白进行筛选（巨噬细胞焦磷酸相关蛋白），通过 LDH 释放实验细胞毒性分析，发现 EST12 对巨噬细胞有显著焦解作用。
2、菌株构建：构建 M. tb H37Rv ΔEST12（Rv1579c 敲除菌株）、BCG-EST12（Rv1579c 过表达菌株）、M. smeg–EST12（Rv1579c 过表达菌株）。
3、小鼠基因敲除模型：NLRP3−/−、GSDMD−/−、caspase-1/11−/−小鼠、RACK1ΔMΦ。
4、检测内容：LDH（乳酸脱氢酶）释放实验检测细胞毒性、ELISA 检测细胞因子分泌、WB 检测、免疫沉淀（IP）、pull down、质谱、EST12 晶体结构、共聚焦显微镜、小鼠结核感染模型等。
研究结果：
1、EST12（Rv1579c）诱导 GSDMD 介导的巨噬细胞焦亡
表达纯化 40 种 RD 区编码蛋白，通过 LDH 释放实验，发现 EST12（Rv1579c）具有明显的巨噬细胞毒性作用。EST12 蛋白导致小鼠腹腔巨噬细胞（图 1A 和 B）、人单核细胞 THP-1（图 1C）和小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）死亡（图 1D）。结果表明，EST12 对巨噬细胞具有较强的毒性。
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导读：
细胞焦亡是一种程序性细胞死亡的炎性形式，与消除病原体感染有关。该文章介绍了一种诱导巨噬细胞焦亡的结核蛋白 EST12。EST12 结合巨噬细胞中活化的 C 激酶 1（RACK1）的受体，EST12-RACK1 复合体募集去泛素化酶 UCHL5 来促进 NLRP3 的 K48 连接去泛素化，随后导致 NLRP3–caspase-1/11–GSDMD–IL-1β免疫过程。EST12 晶体结构分析表明，氨基酸 Y80 是 RACK1 的关键结合位点。EST12 敲除菌株在体内或体外 MTB 感染中都显示出了高易感性。该研究首次证明了 RACK1 作为病原体的内源宿主感应蛋白，并且 EST12-RACK1 诱导的细胞焦亡在 M.tb 诱导的免疫中起关键作用。
研究内容：
1、RD 区编码蛋白筛选：对 40 种 RD 区（RD1-3、11-14）重组蛋白进行筛选（巨噬细胞焦磷酸相关蛋白），通过 LDH 释放实验细胞毒性分析，发现 EST12 对巨噬细胞有显著焦解作用。
2、菌株构建：构建 M. tb H37Rv ΔEST12（Rv1579c 敲除菌株）、BCG-EST12（Rv1579c 过表达菌株）、M. smeg–EST12（Rv1579c 过表达菌株）。
3、小鼠基因敲除模型：NLRP3−/−、GSDMD−/−、caspase-1/11−/−小鼠、RACK1ΔMΦ。
4、检测内容：LDH（乳酸脱氢酶）释放实验检测细胞毒性、ELISA 检测细胞因子分泌、WB 检测、免疫沉淀（IP）、pull down、质谱、EST12 晶体结构、共聚焦显微镜、小鼠结核感染模型等。
研究结果：
1、EST12（Rv1579c）诱导 GSDMD 介导的巨噬细胞焦亡
表达纯化 40 种 RD 区编码蛋白，通过 LDH 释放实验，发现 EST12（Rv1579c）具有明显的巨噬细胞毒性作用。EST12 蛋白导致小鼠腹腔巨噬细胞（图 1A 和 B）、人单核细胞 THP-1（图 1C）和小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）死亡（图 1D）。结果表明，EST12 对巨噬细胞具有较强的毒性。
图 1 巨噬细胞焦亡诱导蛋白 EST12 的鉴定
A-D：分别用 EST12 和 Rv1577 处理小鼠腹腔巨噬细胞（A、B）、PMA 分化的 THP1 细胞（C）、小鼠骨髓巨噬细胞 BMDMS（D），采用 LDH 释放法分析。E：WB 检测 2μＭ EST12 或 RV1577 处理巨噬细胞 GSDMD 活化；F：ELISA 检测 IL-1β分泌；G：WB 检测 H37Rv 和 H37RvΔEST12 感染 BMDMs 细胞后 caspase-1/GSDMD 活性；H：LDH 释放实验检测细胞毒性；I：ELISA 检测 IL-1β分泌；J：WB 检测 BCG 和 BCG-EST12 感染 BMDMs 细胞后 caspase-1/GSDMD 活性；K：LDH 释放实验检测细胞毒性，ELISA 检测 IL-1β分泌。
为确定 GSDMD 和 GSDME 是否参与 EST12 诱导的细胞死亡，2μＭ EST12 刺激小鼠腹腔巨噬细胞不同时间，检测 GSDMD 和 GSDME 活性。发现 2μＭ EST12 刺激小鼠腹腔巨噬细胞 0.5 小时 GSDMD 全长、GSDMD N 端和 C 端被检测到，caspase-1 P20 片段裂解活性增强（图 1E），巨噬细胞 IL-1β分泌增加（1F），EST12 进一步处理人 THP-1 单核细胞来源巨噬细胞，发现 caspase-1 和 GSDMD 被 EST12 裂解。
检测 H37Rv 和 H37RvΔEST12 感染巨噬细胞 caspase-1 和 GSDMD 活性，H37Rv∆EST12 组与 H37Rv 组在感染后 1 小时内无明显变化。在刺激 6h 后，H37Rv 在 BMDMs 中诱导了更多裂解的 caspase-1 p20 和 GSDMD-N 末端片段（图 1G）。与之类似，H37Rv∆EST12 组 LDH 释放和 IL-1β分泌低于 H37Rv 组（图 1H、I）。结果表明，H37Rv∆EST12 组造成的炎性焦亡少于 H37Rv 组。在 BMDMs 中，与 BCG 相比 BCG-EST12 持续诱导更多的 caspase-1 p20 和 GSDMD-N 末端片段（图 1J），细胞毒性和 IL-1 分泌量更高（图 1K）。结果表明，重组 BCG-EST12 较 BCG 诱导 IL-1β表达量和细胞毒性显著升高。
结果小结：EST12 通过 GSDMD 介导巨噬细胞焦亡和炎性细胞因子 IL-1 分泌。
2、EST12 与 RACK1 相互作用诱导巨噬细胞炎性焦亡
为检测细胞中与 EST12 相互作用蛋白，使用 pull down 实验和质谱检测，结果发现 RACK1 蛋白可能是与 EST12 的结合蛋白，免疫印迹进一步验证了这个结果（图 2A）。将 EST12-绿色荧光和 RACK1-红色荧光蛋白表达质粒转染到巨噬细胞 RAW264.7 中，共聚焦荧光显微镜显示 EST12 和 RACK1 在细胞质中定位，产生黄色（图 2B）。qPCR 和 WB 分析结果显示，EST12 刺激巨噬细胞 RACK1 的表达，在 6h 时达到峰值，然后下降（图 2C）, 推测 EST12 在早期促进 RACK1 的表达。
为确定 GSDMD 和 GSDME 是否参与 EST12 诱导的细胞死亡，2μＭ EST12 刺激小鼠腹腔巨噬细胞不同时间，检测 GSDMD 和 GSDME 活性。发现 2μＭ EST12 刺激小鼠腹腔巨噬细胞 0.5 小时 GSDMD 全长、GSDMD N 端和 C 端被检测到，caspase-1 P20 片段裂解活性增强（图 1E），巨噬细胞 IL-1β分泌增加（1F），EST12 进一步处理人 THP-1 单核细胞来源巨噬细胞，发现 caspase-1 和 GSDMD 被 EST12 裂解。
检测 H37Rv 和 H37RvΔEST12 感染巨噬细胞 caspase-1 和 GSDMD 活性，H37Rv∆EST12 组与 H37Rv 组在感染后 1 小时内无明显变化。在刺激 6h 后，H37Rv 在 BMDMs 中诱导了更多裂解的 caspase-1 p20 和 GSDMD-N 末端片段（图 1G）。与之类似，H37Rv∆EST12 组 LDH 释放和 IL-1β分泌低于 H37Rv 组（图 1H、I）。结果表明，H37Rv∆EST12 组造成的炎性焦亡少于 H37Rv 组。在 BMDMs 中，与 BCG 相比 BCG-EST12 持续诱导更多的 caspase-1 p20 和 GSDMD-N 末端片段（图 1J），细胞毒性和 IL-1 分泌量更高（图 1K）。结果表明，重组 BCG-EST12 较 BCG 诱导 IL-1β表达量和细胞毒性显著升高。
结果小结：EST12 通过 GSDMD 介导巨噬细胞焦亡和炎性细胞因子 IL-1 分泌。
2、EST12 与 RACK1 相互作用诱导巨噬细胞炎性焦亡
为检测细胞中与 EST12 相互作用蛋白，使用 pull down 实验和质谱检测，结果发现 RACK1 蛋白可能是与 EST12 的结合蛋白，免疫印迹进一步验证了这个结果（图 2A）。将 EST12-绿色荧光和 RACK1-红色荧光蛋白表达质粒转染到巨噬细胞 RAW264.7 中，共聚焦荧光显微镜显示 EST12 和 RACK1 在细胞质中定位，产生黄色（图 2B）。qPCR 和 WB 分析结果显示，EST12 刺激巨噬细胞 RACK1 的表达，在 6h 时达到峰值，然后下降（图 2C）, 推测 EST12 在早期促进 RACK1 的表达。
图 2 EST12 与 RACK1 相互作用诱导巨噬细胞炎性焦亡
A：RAW264.7 细胞进行 EST12-His pull-down 实验，WB 分析；B：共聚焦显微镜分析分别转染 pEGFP-C1-EST12 和 pAsRED2-C1-RACK1 的 RAW264.7 细胞；C：WB 和 qPCR 分析 2μＭ EST12 刺激的 RAW264.7 细胞；D、E：LDH、ELISA 分析 2μＭ EST12 处理 WT 和 RACK1−/−腹腔巨噬细胞上清；F：WB 检测细胞裂解液中 GSDMD 和 caspase-1；G：2μＭ EST12 处理和 PI 染色 WT、RACK1−/−巨噬细胞；E-J：LDH、ELISA 分析 H37Rv 和 H37RvΔEST12、BCG 和 BCG-EST12、M. smeg 和 M. smeg-EST12 感染 WT、RACK1−/−BMDMs。
研究 EST12 与 RACK1 在巨噬细胞中相互作用，2μＭ EST12 分别刺激 WT 和 RACK1−/−腹腔巨噬细胞，与 WT 巨噬细胞相比，RACK1−/−腹腔巨噬细胞中 EST12 诱导的细胞毒性（图 2D）和 IL-1 分泌（图 2E）显著降低，GSDMD N 片段和 caspase-1 p10 裂解被强烈抑制（图 2F）。实时共焦显微镜分析显示，EST12 导致腹腔巨噬细胞呈现典型的细胞焦亡形态：质膜破裂，多个泡状突起，细胞核内呈 “煎蛋” 状（图 2G）。H37RvΔEST12 感染 WT BMDMs 和 H37Rv 感染 RACK1−/−BMDMs 的细胞凋亡和 IL-1β分泌无区别（图 2H）。BCG-EST12 和 BCG 感染 RACK1−/−BMDMs 的细胞毒性和 IL-1β分泌无明显区别（图 2I）。M. smeg 和 M. smeg-EST12 实验组也是同样结果（图 2J）
结果小结：EST12 通过 RACK1 引起巨噬细胞炎性焦亡。
3、EST12 蛋白 C 端和 Y80 是与 RACK1 结合的关键位点
对 EST12-RACK1 结构预测（图 3B），EST12 与 RACK1 的相互作用可能依赖于 EST12 的第三个螺旋状结构（E55、F76、Y80）。重组蛋白（图 3C）对 RAW264.7 细胞裂解物进行 pull down 实验，然后免疫印迹分析，与 EST12 和 EST12-D2 蛋白相比，EST12-D1（C 端缺失）与 RACK1 几乎没有相互作用（图 3D），Y80A 和 F76A 与 RACK1 的结合作用明显低于 EST12（图 3E）。与 EST12 相比，EST12-D1 的细胞毒性作用也明显减弱（图 3F、G），EST12-E55A、F76A、Y80A 诱导的细胞毒性作用下降，其中 EST12-Y80A 最为明显（图 3H、I）。同样，M. smeg-EST1-D1 和 M. smeg-EST12-Y80A 感染引起的细胞焦亡较 M. smeg-EST12 减少（图 3J、K）。
结果小结：EST12 C 端的 Y80 是 RACK1 引起焦亡的关键结合位点。
研究 EST12 与 RACK1 在巨噬细胞中相互作用，2μＭ EST12 分别刺激 WT 和 RACK1−/−腹腔巨噬细胞，与 WT 巨噬细胞相比，RACK1−/−腹腔巨噬细胞中 EST12 诱导的细胞毒性（图 2D）和 IL-1 分泌（图 2E）显著降低，GSDMD N 片段和 caspase-1 p10 裂解被强烈抑制（图 2F）。实时共焦显微镜分析显示，EST12 导致腹腔巨噬细胞呈现典型的细胞焦亡形态：质膜破裂，多个泡状突起，细胞核内呈 “煎蛋” 状（图 2G）。H37RvΔEST12 感染 WT BMDMs 和 H37Rv 感染 RACK1−/−BMDMs 的细胞凋亡和 IL-1β分泌无区别（图 2H）。BCG-EST12 和 BCG 感染 RACK1−/−BMDMs 的细胞毒性和 IL-1β分泌无明显区别（图 2I）。M. smeg 和 M. smeg-EST12 实验组也是同样结果（图 2J）
结果小结：EST12 通过 RACK1 引起巨噬细胞炎性焦亡。
3、EST12 蛋白 C 端和 Y80 是与 RACK1 结合的关键位点
对 EST12-RACK1 结构预测（图 3B），EST12 与 RACK1 的相互作用可能依赖于 EST12 的第三个螺旋状结构（E55、F76、Y80）。重组蛋白（图 3C）对 RAW264.7 细胞裂解物进行 pull down 实验，然后免疫印迹分析，与 EST12 和 EST12-D2 蛋白相比，EST12-D1（C 端缺失）与 RACK1 几乎没有相互作用（图 3D），Y80A 和 F76A 与 RACK1 的结合作用明显低于 EST12（图 3E）。与 EST12 相比，EST12-D1 的细胞毒性作用也明显减弱（图 3F、G），EST12-E55A、F76A、Y80A 诱导的细胞毒性作用下降，其中 EST12-Y80A 最为明显（图 3H、I）。同样，M. smeg-EST1-D1 和 M. smeg-EST12-Y80A 感染引起的细胞焦亡较 M. smeg-EST12 减少（图 3J、K）。
结果小结：EST12 C 端的 Y80 是 RACK1 引起焦亡的关键结合位点。
图 3 Y80 是 RACK1 的关键结合位点
A：EST12 晶体结构；B：EST12-RACK1 预测结构；C：重组蛋白全长、EST12 C 端缺失（EST12- D1）、N 端缺失（EST12- D2）、EST12 的 3 个突变体图示；D-E：重组蛋白 pull down 及 WB 分析；F-I：LDH 分析重组蛋白不同时间、不同剂量处理腹腔巨噬细胞；J-K：LDH 分析 M. smeg 和 M. smeg-est12、EST12-D1、EST12-D2、EST12-E55A、EST12-F76A、EST12-Y80A 感染 BMDMs。
4、EST12-RACK1 通过 NLRP3 和 GSDMD 引起巨噬细胞焦亡和 IL-1 分泌
炎症小体的激活是对抗细菌感染的关键防御机制，细菌感染可诱发先天性免疫反应，如 caspase-1 激活和炎症细胞死亡。mRNA 芯片分析 EST12 处理 RAW264.7 细胞，结果显示 NLRP3、IL-1β、IL-6 和 TNF-α表达上调。8 个 PYRIN 结构域蛋白（NLRP1b、NLRP2、NLRP3、NLRP5、NLRP6、NLRP9、NLRP12、PYRIN）通过 EST12 处理后，NLRP3 的 mRNA 表达在巨噬细胞显著改变（图 4A）。在 EST12 刺激 6 小时后，免疫印迹分析 NLRP3 蛋白表达上升达到最高（图 4B）。共聚焦显微镜分析显示，NLRP3 表达在 EST12 刺激后 6 小时最高（图 4C）。EST12 处理后，RACK1−/−中 NLRP3 表达明显受损（图 4D）。
结果小结：EST12 导致 NLRP3 的表达依赖于 RACK1。
4、EST12-RACK1 通过 NLRP3 和 GSDMD 引起巨噬细胞焦亡和 IL-1 分泌
炎症小体的激活是对抗细菌感染的关键防御机制，细菌感染可诱发先天性免疫反应，如 caspase-1 激活和炎症细胞死亡。mRNA 芯片分析 EST12 处理 RAW264.7 细胞，结果显示 NLRP3、IL-1β、IL-6 和 TNF-α表达上调。8 个 PYRIN 结构域蛋白（NLRP1b、NLRP2、NLRP3、NLRP5、NLRP6、NLRP9、NLRP12、PYRIN）通过 EST12 处理后，NLRP3 的 mRNA 表达在巨噬细胞显著改变（图 4A）。在 EST12 刺激 6 小时后，免疫印迹分析 NLRP3 蛋白表达上升达到最高（图 4B）。共聚焦显微镜分析显示，NLRP3 表达在 EST12 刺激后 6 小时最高（图 4C）。EST12 处理后，RACK1−/−中 NLRP3 表达明显受损（图 4D）。
结果小结：EST12 导致 NLRP3 的表达依赖于 RACK1。
图 4 EST12 通过 RACK1 诱导 NLRP3 炎症小体的激活
A：qPCR 分析 EST12 蛋白处理的小鼠腹腔巨噬细胞 8 个 PYRIN 结构域蛋白的 mRNA 表达水平；B-C：WB 和共聚焦显微镜检测 EST12 蛋白刺激的 RAW264.7 细胞；D：qPCR 分析 EST12 处理 WT 和 RACK1−/−腹腔巨噬细胞的 NLRP3 mRNA 表达水平；E：IP 和 WB 分析质粒转染后 EST12 刺激的 RAW264.7 细胞；F：WB 分析裂解的 BMDMs 细胞的 pull down 蛋白；G-J：IP 和 WB 分析 EST12 处理的 BMDMs 细胞；K：共聚焦显微镜分析 EST12 处理后的 WT 和 RACK1−/−腹腔巨噬细胞；L：IP 和 IB 分析 EST12 处理或未预处理的腹腔巨噬细胞。
将编码 WT 泛素（H-Ub）、突变 H-Ub（K48）和 H-Ub（K63）质粒转染至 RAW264.7 细胞，通过 IP 和 WB 实验，推测 EST12 介导了 K48 连接的 NLRP3 去泛素化（图 4E）。WB 分析 EST12 处理的 RAW 264.7 细胞裂解液 pull down 蛋白，进一步验证 EST12 和去泛素酶 UCHL5 的相互作用（图 4F）。通过免疫共沉淀分析，发现在 EST12 处理后，NLRP3 和 RACK1 均直接与 UCHL5 相互作用（图 4,G-I），而 EST12-Y80A 处理不能促进 RACK1 与 UCHL5、NLRP3 的相互作用（图 4,H 和 I）。UCHL5 敲低株在 EST12 刺激后，NLRP3 的 K48 去泛素化明显降低（图 4J），结果表明 EST12 刺激后通过 UCHL5 介导 NLRP3 K48 连接的去泛素化。免疫荧光分析发现 EST12 存在时 ASC 斑点的形成，但在 EST12 处理的 RACK1−/−腹腔巨噬细胞中却没有发现（图 4K）。IP 和 WB 实验发现 NLRP3 可以同时沉淀 ASC 和 pro-caspase-1，ASC 也可以沉淀 NLRP3 和 pro-caspase-1（图 4L）。
结果小结：在 EST12 处理后，NLRP3、ASC 和 pro-caspase-1 可以组装成 NLRP3 炎性小体。
将编码 WT 泛素（H-Ub）、突变 H-Ub（K48）和 H-Ub（K63）质粒转染至 RAW264.7 细胞，通过 IP 和 WB 实验，推测 EST12 介导了 K48 连接的 NLRP3 去泛素化（图 4E）。WB 分析 EST12 处理的 RAW 264.7 细胞裂解液 pull down 蛋白，进一步验证 EST12 和去泛素酶 UCHL5 的相互作用（图 4F）。通过免疫共沉淀分析，发现在 EST12 处理后，NLRP3 和 RACK1 均直接与 UCHL5 相互作用（图 4,G-I），而 EST12-Y80A 处理不能促进 RACK1 与 UCHL5、NLRP3 的相互作用（图 4,H 和 I）。UCHL5 敲低株在 EST12 刺激后，NLRP3 的 K48 去泛素化明显降低（图 4J），结果表明 EST12 刺激后通过 UCHL5 介导 NLRP3 K48 连接的去泛素化。免疫荧光分析发现 EST12 存在时 ASC 斑点的形成，但在 EST12 处理的 RACK1−/−腹腔巨噬细胞中却没有发现（图 4K）。IP 和 WB 实验发现 NLRP3 可以同时沉淀 ASC 和 pro-caspase-1，ASC 也可以沉淀 NLRP3 和 pro-caspase-1（图 4L）。
结果小结：在 EST12 处理后，NLRP3、ASC 和 pro-caspase-1 可以组装成 NLRP3 炎性小体。
图 5 EST12-RACK1 通过 NLRP3 和 GSDMD 引起巨噬细胞焦亡和 IL-1 分泌
A-C：LDH、ELISA 分析 EST12 处理的 WT、NLRP3-/-和 GSDMD-/-腹腔巨噬细胞毒性分析及 IL-1β分泌；D：WB 检测 EST12 处理的 WT、NLRP3-/-腹腔巨噬 GSDMD 和 caspase-1 的活性；E：WB 检测 EST12 和 EST12-Y80A 处理的腹腔巨噬细胞 GSDMD 的活性；F-H：LDH、ELISA、WB 检测 EST12 处理 WT 和 caspase-1/11−/−腹腔巨噬细胞毒性分析、IL-1β分泌及 GSDMD 的活性；I、J：LDH、ELISA 分析 H37Rv、H37RvΔEST12 及 BCG、BCG-EST12 感染 WT、NLRP3−/−、GSDMD−/−和 caspase-1/11−/−BMDMs 细胞 6 小时后细胞毒性和 IL-1β分泌。
ST12 处理 GSDMD−/−或 NLRP3−/−小鼠的腹腔巨噬细胞，与 WT 小鼠腹腔巨噬细胞相比，细胞毒性相比明显下降（图 5A、B）；上清中未检测到 IL-1β（图 5C）；检测 EST12 对 NLRP3−/−腹腔巨噬细胞 caspase-1 和 GSDMD 裂解的影响，发现两者均未显示活化作用（图 5D）。EST12-Y80A 处理 WT 巨噬细胞未裂解 GSDMD（图 5E）。IL-1β分泌明显降低（图 5F、G），未观察到 GSDMD 的裂解（图 5H），结果表明 EST12 通过 caspase-1 引发巨噬细胞 GSDMD 介导的焦解和 IL-1 分泌。H37Rv 与 H37RvΔEST12 感染 NLRP3−/−、GSDMD−/−、caspase-1/11−/−BMDMs 细胞毒性、IL-1β分泌并无差异，除 WT BMDMs（图 5I）。BCG-EST12 和 BCG 感染也是类似情况。
结果小结：EST12-Y80 通过 RACK1、NLRP3、GSDMD、caspase-1 触发巨噬细胞焦亡和 IL-1 分泌。
5、EST12 激活宿主免疫反应，增强分枝杆菌清除
在感染过程中，被感染巨噬细胞的焦亡作用是激活宿主免疫系统的必要条件。构建 M.tb H37Rv 和 H37RvΔEST12 小鼠感染模型，感染 30 天后，进行肺部菌落计数、血清中 IL-1β检测及肺部切片抗酸染色（图 6A-C）。肺部切片 HE 染色病理学分析中，H37RvΔEST12 感染组相较于 H37Rv 组，淋巴细胞浸润增多、肺泡间隔变小（图 6D）。BCG-EST12 相较于 BCG 感染的小鼠肺部载菌量降低（图 6E）、IL-1β分泌增加（图 6F），病理分析显示感染 BCG 组肺泡组织损伤较 BCG-EST12 组严重（图 6G）。对不同细菌感染后的 WT BMDMs 进行菌落计数，在 WT BMDMs 中，BCG-EST12 感染与 BCG 组相比，在 3 和 6 hpi 时 CFUs 更少（图 6H）。BCG-EST12 和 BCG 感染 RACK1−/−,NLRP3−/−,GSDMD−/−和 caspase-1/11−−/BMDMs 后，菌落计数没有不同（图 6I、J）。
结果小结：EST12 增加了巨噬细胞和小鼠对 M. tb 感染抵抗力 , 它通过 RACK1-、NLRP3、GSDMD 和 caspase-1/11-介导的炎症焦亡在 M. tb 诱导免疫中扮演关键的角色。
ST12 处理 GSDMD−/−或 NLRP3−/−小鼠的腹腔巨噬细胞，与 WT 小鼠腹腔巨噬细胞相比，细胞毒性相比明显下降（图 5A、B）；上清中未检测到 IL-1β（图 5C）；检测 EST12 对 NLRP3−/−腹腔巨噬细胞 caspase-1 和 GSDMD 裂解的影响，发现两者均未显示活化作用（图 5D）。EST12-Y80A 处理 WT 巨噬细胞未裂解 GSDMD（图 5E）。IL-1β分泌明显降低（图 5F、G），未观察到 GSDMD 的裂解（图 5H），结果表明 EST12 通过 caspase-1 引发巨噬细胞 GSDMD 介导的焦解和 IL-1 分泌。H37Rv 与 H37RvΔEST12 感染 NLRP3−/−、GSDMD−/−、caspase-1/11−/−BMDMs 细胞毒性、IL-1β分泌并无差异，除 WT BMDMs（图 5I）。BCG-EST12 和 BCG 感染也是类似情况。
结果小结：EST12-Y80 通过 RACK1、NLRP3、GSDMD、caspase-1 触发巨噬细胞焦亡和 IL-1 分泌。
5、EST12 激活宿主免疫反应，增强分枝杆菌清除
在感染过程中，被感染巨噬细胞的焦亡作用是激活宿主免疫系统的必要条件。构建 M.tb H37Rv 和 H37RvΔEST12 小鼠感染模型，感染 30 天后，进行肺部菌落计数、血清中 IL-1β检测及肺部切片抗酸染色（图 6A-C）。肺部切片 HE 染色病理学分析中，H37RvΔEST12 感染组相较于 H37Rv 组，淋巴细胞浸润增多、肺泡间隔变小（图 6D）。BCG-EST12 相较于 BCG 感染的小鼠肺部载菌量降低（图 6E）、IL-1β分泌增加（图 6F），病理分析显示感染 BCG 组肺泡组织损伤较 BCG-EST12 组严重（图 6G）。对不同细菌感染后的 WT BMDMs 进行菌落计数，在 WT BMDMs 中，BCG-EST12 感染与 BCG 组相比，在 3 和 6 hpi 时 CFUs 更少（图 6H）。BCG-EST12 和 BCG 感染 RACK1−/−,NLRP3−/−,GSDMD−/−和 caspase-1/11−−/BMDMs 后，菌落计数没有不同（图 6I、J）。
结果小结：EST12 增加了巨噬细胞和小鼠对 M. tb 感染抵抗力 , 它通过 RACK1-、NLRP3、GSDMD 和 caspase-1/11-介导的炎症焦亡在 M. tb 诱导免疫中扮演关键的角色。
图6 EST12激活宿主免疫反应增加分枝杆菌清除
A：小鼠感染 H37Rv、H37RvΔEST12 菌株 30 天后，肺部菌落计数；B：ELISA 检测血清中 IL-1β；C：H37Rv、H37RvΔEST12 感染小鼠肺部切片抗酸染色；D：H37Rv、H37RvΔEST12 感染小鼠肺部切片 HE 染色；E：小鼠感染 BCG、BCG-EST12 肺部菌落计数；F：ELISA 检测血清中 IL-1β；G：BCG、BCG-EST12 感染小鼠肺部切片 HE 染色；H-J：WT（H）和 RACK1−/−（J） BMDMs 感染 BCG 和 BCG-EST12 或 WT，NLRP3−/−，GSDMD−/−，caspase-1/11−/−BMDMs（I）感染 6 小时菌落计数。
结论：
EST12 通过与巨噬细胞 RACK1 相互作用而引起细胞焦亡。RACK1 作为检测 M. tb EST12 的主要宿主因子，并招募去泛素酶 UCHL5 促进 NLRP3 去泛素化，进而激活巨噬细胞 NLRP3 炎性小体-caspase-1-GSDMD 细胞焦亡-IL-1β分子免疫通路。该研究阐释了巨噬细胞与 EST12 之间的相互作用，并证实了 EST12-RACK1 诱导的细胞焦亡在 M. tb 诱导免疫中的关键作用。
结论：
EST12 通过与巨噬细胞 RACK1 相互作用而引起细胞焦亡。RACK1 作为检测 M. tb EST12 的主要宿主因子，并招募去泛素酶 UCHL5 促进 NLRP3 去泛素化，进而激活巨噬细胞 NLRP3 炎性小体-caspase-1-GSDMD 细胞焦亡-IL-1β分子免疫通路。该研究阐释了巨噬细胞与 EST12 之间的相互作用，并证实了 EST12-RACK1 诱导的细胞焦亡在 M. tb 诱导免疫中的关键作用。
晶诺生物为本研究构建了EST12敲除菌株并提供相关技术支持
上海晶诺生物科技有限公司专注于结核分枝杆菌相关研究，专业提供结核分枝杆菌突变体构建技术服务和产品，已多次助力科研团队攻关重要结核基础研究工作！目前晶诺已完成将近1800个结核分枝杆菌基因敲除菌株，还在持续更新中！请联系我们了解更多信息！
文献来源：
https://advances.sciencemag.org/content/6/43/eaba4733
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