细胞污染你知多少？ 细胞实验室污染的预防
Eppendorf 艾本德中国有限公司
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1. 细胞污染的种类
细胞污染一般可分为微生物污染和真核生物污染。其中微生物污染包括真菌和酵母、细菌、支原体等。而真核生物一般是细胞系间的交叉污染。
细菌、真菌或酵母的污染很容易辨识，直接可通过培养基颜色变化、显微镜下观察便可判断。如细菌污染后细胞培养基变黄色，而且镜下有小黑点，且有规律的运动。而酵母污染后培养基变紫色，镜下可见透明、且连成一串的圆形。但如果是支原体污染的话，由于最开始支原体生长缓慢，而且显微镜下难以看出，因此很难发现。
真核细胞污染是指一种细胞污染了另外一种细胞，主要发生在操作不当，尤其是长时间进行某些细胞系的研究而传代时。目前越来越多的科研人员发现了细胞间污染这一被忽略的问题。据不完全统计，约有 15-20% 的细胞存在细胞间污染。
2. 细胞污染对实验的影响
不管发生哪种类型的污染都会造成相同的结果。即必须重新做实验，因此浪费工作时间，增加实验成本，降低实验重复性。而且以污染细胞和未污染细胞为基础进行试验时，有可能得到的实验结果完全不同。更为严重的是，如果你所研究的细胞是另外一种细胞的话，那所做的所有工作可能会一文不值。
目前，学术界对细胞污染的报道越来越多。《The Scientist》期刊的 2008 年 9 月 16 日期发表了 Megan Scudellari 撰写的题为 A case of mistaken identity 的文章，文中指出现已发表的 650 多项研究中所用的乳腺癌细胞可能并不是真正的乳腺癌细胞。
《Nature》于 2009 年发表了一篇以 Identity crisis 为题的社论文章，发表了一株细胞系约 18%-36% 的污染事件。时至今日，遭污染的细胞系已经进入上千家实验室，并且多家实验室发表的论文所使用的就是这一细胞系。
Josephine Nefkens 研究所的分子生物学家 Winand Dinjens 发现，在 13 株食管腺癌细胞系中，其中 3 株，SEG-1，BIC-1 和 SK-GT-5 被污染，这些细胞株混合有其他癌细胞。
科罗拉多大学的遗传学家 Christopher Korch 发现，在过去 15 年期间，他发表的文章中有 78 株广泛应用的细胞系被证明受到了污染。 其中有两株存在严重污染的"明星"细胞系。一个是 HEp-2 细胞系，有 5789 篇文章中使用的 HEP-2 存在 HELA 细胞的污染；另外一个是 INT 407 细胞系，有 1336 篇文章中使用的这种细胞系同样受到了 HELA 细胞的污染。这篇题为 〈Line of Attack 〉 的文章发表 2015 年 〈Science〉 杂志上。
此外，国际细胞权威机构（ICLAC）在 2012 年建立了标准，并建立交叉污染数据库，和鉴定错误的细胞系。
《Nature》宣布从 2015 年 5 月 1 日起，Nature 及子刊文章所用细胞需要审查。
对于大多数细胞来说，可通过 DNA 测序或 STR 技术来鉴定细胞系是否被污染。
3. 如何预防污染
对于细胞培养实验室来说，最重要的是杜绝一切可能的污染源。污染的来源可分为直接和间接两类。直接污染指使用试剂带来的污染或者所培养的细胞已经被污染。间接污染可能来自于实验室、实验设备或者我们自己本身。因此如何预防污染的发生是细胞实验室日常工作的重中之重。
如果实验室引入一种新的细胞，或者一直培养保存的细胞，但对保存细胞从未检测过，就有可能给实验室带来污染。因此使用前先检测新引入细胞株，或检测保存细胞是否纯净无污染。
对于培养基等试剂的选择，必须在符合 GMP/GLP 规定的厂房生产，并且需要对血清进行常规污染检测，以及建立良好的分装习惯和体系。
而且实验室是否保持洁净，实验设备是否保持无菌，以及操作环节的正确操作，都可避免污染产生。因此必须遵照严格的无菌操作规范和管理。
1) CO2 培养
选择具有无风扇设计、一体成型的培养箱体，便于清洁，并大大减少污染源。其次可能的话 ，使用具有自动灭菌功能培养箱，即铜质箱体。
对于日常使用来说，至少每月清洁培养箱一次，并尽量减少门打开次数，避免对温度、培养基中 pH 值调节的影响。
2) 合适的移液工具
如果移液操作过程误操作，那么分装样品有可能存在污染。因此选择合适的移液器和高品质耗材，是确保分装样品洁净的保证。跟实验室常用的双按钮移液器相比，单按钮移液器能更好的减少气溶胶污染，因为单按钮移液器打出吸头时活塞无需回弹，而且直接按下去。
3) 具有生物安全柜功能的滤芯吸头
移液操作中除移液器外，还可通过使用滤芯吸头来降低气溶胶污染。Eppendorf 的滤芯吸头具有两层滤芯和不同孔径，确保超高的阻隔效率。 其滤芯性能符合 EN 1822 标准 (空气过滤的级别)，具有 HEPA E12 级的过滤性能。
4) 使用培养瓶培养细胞，尤其是透气盖培养瓶
相比培养皿或培养板，培养瓶只有瓶口可以与外界联通，因此减少外界气体及微生物与培养细胞接触，减少污染几率。具有滤膜的透气瓶盖，可更加有效的防止细菌、病毒，以及支原体等的污染。Eppendorf 培养瓶透气盖的滤膜具有多种孔径，且瓶盖可侧立放置，有效地阻隔微生物及气溶胶污染。
5) 可重复密封的包装
细胞培养耗材必须是无菌、无热源的，因此能够重复密封的耗材包装是未使用耗材无菌保存的保证。Eppendorf 细胞培养耗材具有重复密封、可压缩的包装，无需工具便可方便打开或密封，确保产品无菌，并提高实验室管理。
