细胞 5 大污染源头与防治措施

物理性污染常常被人们所忽视或被笼统地归为化学性污染。物理性污染通过影响细胞培养体系中的生化成分，从而影响细胞的代谢。

 

培养环境中的物理因素，如温 度、放射线、振动、辐射(紫外线或荧光)会对细胞产生影响 。细胞、培养液或其它培养试剂暴露于放射线、辐射或过冷过热的温度中，可以引起细胞代谢发生改变，如细胞同步化、细胞生长受抑制甚至细胞死亡。

 

如何防治？

 

通过实验室 的合理设计及建立规范的操作规程，可以减少环境中物理因素对细胞的影响。孵箱应放在温度较恒定的环境中，周围不能放置能引起机械振动的设备，如离心机。

 

培养液及培养试剂应放在固定的位置，为避免光照试剂不能放在玻璃门的冰箱中，试剂周围不能放同位素。培养液从冰箱中取出后应在室温中放置一段时间后再进行实 验，以避免过冷的温度对细胞的影响。

 

2、化学性污染的来源、危害及预防 　

 

培养环境中许多化学物质都可以引起细胞的污染 。化学物质并不总是抑制细胞的生长，某些化学物质如激素就可促进细胞的生长。不同细胞对化学物质污染的反应是不一样的。

 

未纯化的物质、试剂、水、血清、生 长辅助因子及储存试剂的容器都可能成为化学性污染的来源。细胞培养的必需养分，如氨基酸，若浓度超过了合适的范围，也会对细胞产生毒性。

 

同样，不同细胞系 其最佳培养条件下对血清和缓冲液的要求是不一样的，在培养中应严格控制。玻璃制品清洗过程中残留的变性剂或肥皂(通常残留在瓶盖的内表面)是最常见的化学性污染。水是唯一一种在凝固时，膨胀的化合物。

 

如何防治？

 

因此在选择冻存细胞的容器时应考虑到这个因素。容器因水的膨胀而发生破裂是引起试剂污染的重要原因。为了避免金属离子、有机分子、细胞内毒 素等物质对水的污染，在配制液体，清洗容器时必须使用不含杂质的超纯水。

 

需要注意的是，超纯水放置过久其纯度会下降。在高压蒸气灭菌及蒸馏水时水经常被污染，因为高压蒸气锅及纯水机的常规维护后可能有少量的化学物质残留。

 

为了保证水的纯度，我们应采取措施尽量避免化学物质的残留。动物血清是细胞培养中常用的天然培养基，但血清又是潜在的生物及化学污染的来源。由于血清采集于多个动物，而且不同厂商的生产工艺及质量各不相同，因此血 清中许多成分的浓度存在很大的变异。血清对不同细胞的促生长能力及毒副作用取决于这些细胞的分化功能、组织来源及培养基的成分等因素。

 

在进行一系列实验时，为了保证实验的可重复性，最好选用同一批次的血清。培养液、培养附加成分、试剂 　培养液、培养附加成分、试剂都可能成为化学性污染的来源。细胞培养使用的所有物质都应是高纯度的，并经过权威机构的鉴定，实验者本人也应对上述成分进行 纯度鉴定。同时，正确配置和储存培养液及试剂也是非常重要的，应该采取标准的操作步骤，避免液体体积计算错误，混用类似化合物等错误。

 

3、培养器皿及容器 　

 

细胞培养过程中会使用到各种不同的培养器皿及容器。培养器皿的大小，构形设计可能会影响到培养中气体交换、湿度、培养液的pH值和细胞生长密度。培养器 皿的工艺及灭菌过程中的差异可能对培养体系产生影响。

 

塑料制品在生产过程中可能残留一些有毒成形剂，生产工艺的不同可能引起器皿表面附着能力的不同。储存 不同物质时应选用合适的塑料或玻璃容器，因为酒精、强酸、强碱能够溶解塑料或玻璃的某些成分。

 

4、微生物污染

 

由于体外培养的细胞自身没有抵抗污染的能力，而在培养基中加抗生素的抗污染能力也是有限的，因而细胞微生物污染一旦发生往往是无法挽救的。一般在细胞受到污染早期或污染较轻时，能及时处理并除去污染物，部分细胞还有可能得到挽救。但当细胞持续在污染环境中生长时，轻者细胞生长缓慢，分裂相减少，细胞变得粗糙，轮廓增强，胞浆中出现较多的颗粒物质；较重的细胞增殖停止，分裂相消失，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆或崩解，从瓶壁脱落。

 

不同的微生物污染物对细胞的影响也有差别，微生物中支原体和病毒对细胞形态和技能的影响是长期的，缓慢的和潜在的。而霉菌和细菌增殖迅速，能在很短的时间内抑制细胞生长或产生有毒物质杀灭细胞。

 

5、霉菌污染

 

表现：真菌的种类很多，污染的多是曲霉菌，白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，孢子菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成淡黄色或是白色的漂浮物，一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不变混浊。

 

倒置显微镜下可以看见细胞之间有纵横交错穿行的丝状，树枝状或管状菌丝，并漂浮在培养液中。很多菌丝在高倍镜下可以看见链状排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圆形，散在细胞上及细胞周边生长。有时通过显微镜可能会发现在培养瓶外壁生长的菌丝，较易误认为污染。发现瓶外的菌丝后应及时用酒精擦拭干净。

 

如何防治：

 

首先，需确定污染物是细菌、真菌、支原体，还是酵母。现在你确认是霉菌污染。因此，尽快把污染细胞与其它细胞系隔离开，同时需要对实验过程中所用的器材和试剂做处理。一般来说，高浓度的抗生素和抗霉菌素都可能对细胞或细胞系有毒性作用，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。

 

二、下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤

 

1) 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。

2) 分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

3) 每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。

4) 确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2－3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2－3代。

5) 在无抗生素的培养基中培养细胞一代。

6) 重复步骤4

7) 在无抗生素的培养基中培养 4－6 代，确定污染。

 

三、细胞污染对实验的影响

《Nature》于 2009 年发表了一篇以 Identity crisis 为题的社论文章，发表了一株细胞系约 18%-36% 的污染事件。时至今日，遭污染的细胞系已经进入上千家实验室，并且多家实验室发表的论文所使用的就是这一细胞系。

Josephine Nefkens 研究所的分子生物学家 Winand Dinjens 发现，在 13 株食管腺癌细胞系中，其中 3 株，SEG-1，BIC-1 和 SK-GT-5 被污染，这些细胞株混合有其他癌细胞。

科罗拉多大学的遗传学家 Christopher Korch 发现，在过去 15 年期间，他发表的文章中有 78 株广泛应用的细胞系被证明受到了污染。 其中有两株存在严重污染的「明星」细胞系。一个是 HEp-2 细胞系，有 5789 篇文章中使用的 HEP-2 存在 HELA 细胞的污染；另外一个是 INT 407 细胞系，有 1336 篇文章中使用的这种细胞系同样受到了 HELA 细胞的污染。这篇题为 《Line of Attack 》的文章发表 2015 年《Science》 杂志上。

 

 

此外，国际细胞权威机构（ICLAC）在 2012 年建立了标准，并建立交叉污染数据库，和鉴定错误的细胞系。《Nature》宣布从 2015 年 5 月 1 日起，Nature 及子刊文章所用细胞需要审查。对于大多数细胞来说，可通过 DNA 测序或 STR 技术来鉴定细胞系是否被污染。

 

对于细胞培养实验室来说，最重要的是杜绝一切可能的污染源。污染的来源可分为直接和间接两类。直接污染指使用试剂带来的污染或者所培养的细胞已经被污染。间接污染可能来自于实验室、实验设备或者我们自己本身。因此如何预防污染的发生是细胞实验室日常工作的重中之重。

 

 

如果实验室引入一种新的细胞，或者一直培养保存的细胞，但对保存细胞从未检测过，就有可能给实验室带来污染。因此使用前先检测新引入细胞株，或检测保存细胞是否纯净无污染。

 

对于培养基等试剂的选择，必须在符合 GMP/GLP 规定的厂房生产，并且需要对血清进行常规污染检测，以及建立良好的分装习惯和体系。而且实验室是否保持洁净，实验设备是否保持无菌，以及操作环节的正确操作，都可避免污染产生。因此必须遵照严格的无菌操作规范和管理。

 

 

 

选择具有无风扇设计、一体成型的培养箱体，便于清洁，并大大减少污染源。其次可能的话 ，使用具有自动灭菌功能培养箱，即铜质箱体。对于日常使用来说，至少每月清洁培养箱一次，并尽量减少门打开次数，避免对温度、培养基中 pH 值调节的影响。

 

 

 

如果移液操作过程误操作，那么分装样品有可能存在污染。因此选择合适的移液器和高品质耗材，是确保分装样品洁净的保证。跟实验室常用的双按钮移液器相比，单按钮移液器能更好的减少气溶胶污染，因为单按钮移液器打出吸头时活塞无需回弹，而且直接按下去。

 

 

 

移液操作中除移液器外，还可通过使用滤芯吸头来降低气溶胶污染。

 

 

 

相比培养皿或培养板，培养瓶只有瓶口可以与外界联通，因此减少外界气体及微生物与培养细胞接触，减少污染几率。具有滤膜的透气瓶盖，可更加有效的防止细菌、病毒，以及支原体等的污染。

 

 

 

细胞培养耗材必须是无菌、无热源的，因此能够重复密封的耗材包装是未使用耗材无菌保存的保证。