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血涂片制作和白细胞分类计数

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目的与原理

了解各种类型白细胞的形态特征,掌握血涂片制作方法和白细胞分类计数方法,进行不同鱼类白细胞分类计数和血细胞形态特征、变形率等的观察。

白细胞依据其形状、染色颗粒、细胞质和细胞核的形状大小可以进行分类。通常的分类方法是根据细胞浆中有无特殊的嗜色颗粒,将其分成颗粒细胞和无颗粒细胞。颗粒细胞又依据所含颗粒对染色剂反应特性,被区分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞;无颗粒细胞则分成单核细胞和淋巴细胞。

中性粒细胞有较强的吞噬能力,能将侵入机体的微生物消灭掉,并可参与免疫复合物和坏死组织的清除工作。嗜酸性粒细胞的细胞内含有过氧化物酶和酸性磷酸酶,吞噬能力与中性粒细胞相当或稍弱,能吞噬抗原-抗体复合物,此外,嗜酸性粒细胞具有抗炎作用。

嗜碱性粒细胞含有多种化学物质,如组织胺、肝素和5-羟色胺等,当抗原-抗体发生反应时,或机体在寒冷环境中时,都能引起嗜碱性粒细胞释放组织胺和肝素。血液中的单核细胞穿出血管壁进入组织,变成巨噬细胞,可对抗组织内的致病物,各种细菌和病毒。

淋巴细胞有免疫功能,对异己构型的物质具有杀灭和消除作用。 各种白细胞必须经过染色,才易于区分其类别。常用者为瑞氏(Wright’s)染色法和姬姆萨(Giemsa)染色法。

试剂与器材

试剂:

染色液的配制:

1. 姬姆萨(Giemsa)染液的配制

(1)原液配制

Giemsa 粉剂 0.8 g

甘油(医用) 50 ml

甲醇 50 ml

将Giemsa粉剂溶于甲醇中,在乳钵中充分研磨,溶解后再加甘油,混合均匀,置于37~40℃温箱内8~12h,过滤,装入棕色试剂瓶内,密封保存备用。

(2)稀释液

临用时取Giemsa原液5ml,加磷酸盐缓冲液(pH6.4~6.8)50 ml,即为Giemsa稀释液。

(3)pH6.4~6.8磷酸盐缓冲液

取磷酸二氢钾(无水)0.3g,磷酸氢二钠(无水)0.2g,加少量蒸馏水溶解,调整pH至6.4~6.8,加水至1000ml。

2. 瑞氏(Wright′s)染液的配制

(1)原液配制

瑞氏染料粉剂 0.1g

纯甲醇 60 ml

(2)配制步骤:

① 将瑞氏染料粉放人乳钵内,加少量甲醇研磨。

② 将已溶解的染料倒入洁净的玻璃瓶内,剩下未溶解的染料再加入少量甲醇进行研磨,如此反复操作,直至全部染料溶解为止。

③ 装入玻璃瓶内密封,在室温下保存一周即可使用。

④ 新鲜配制的染料偏碱性,放置后呈酸性,染液储存时间越久,染色愈好。

器材:

显微镜,香柏油,载玻片,盖玻片,玻片水平支架,采血针或注射器,计数器,小滴管,蜡笔,消毒棉球,瑞氏染液,pH6.4~6.8磷酸盐缓冲液,姬姆萨染液,蒸馏水。

实验步骤

1. 血涂片的制作:取一滴血(采血方法见实验49),滴于洁净无油脂的玻片一端。左手持玻片,右手再取边缘光滑的另一玻片作为推片。将推片边缘置于血滴前方,然后向后拉,当与血滴接触后,血即均匀附在二玻片之间。此后以二玻片约呈30—45度的角度平稳地向前推至玻片另一端(图一)。推时角度要一致,用力应均匀,即推出均匀的血膜(血膜不可过厚、过薄)。将制好的血涂片晾干,不可加热

2. 血涂片的染色步骤:
(1)用蜡笔在血膜两端各划一道线,以免染料外溢,置涂片于水平的支架上。
(2)用小滴管将瑞氏染液滴于涂片上,并盖满划出的涂片部分固定约半分钟。
(3)用小滴管再加1.5倍缓冲液或姬姆萨(Glemsa)染液,轻轻摇动,并轻吹液体使染色液与缓冲液混合均匀,静置5~10分钟。

(4)用蒸馏水冲洗(如自来水的pH值稳定于7.2左右时亦可代用)。冲洗血膜时应将玻璃片持平,冲洗后斜置血涂片于空气中干燥。或先用滤纸吸取水分迅速干燥,即可镜检。

3. 白细胞分类计数:先用低倍镜检查涂片及染色是否均匀。然后加一滴香柏油于血膜厚薄均匀处(一般在体尾交界处),在油镜下由此处开始按其形态特征进行分类计数,计数移动时避免重复。根据所见到的100个白细胞,记录各种白细胞所占的百分数。
例如:嗜中性白细胞分数(%)=计数嗜中性白细胞个数/计数总白细胞个数×100%。
图一、血涂片制备示意图
红细胞呈桔红色;中性粒细胞核为蓝紫色,颗粒呈蓝紫至紫红色;嗜酸性粒细胞颗粒呈鲜红至桔红色;嗜碱性粒细胞颗粒呈深蓝紫色;淋巴细胞核呈深蓝紫色,胞质呈天蓝色;单核细胞核呈浅紫色,胞质呈灰蓝色。

方法评估
显微镜法白细胞分类是经典、传统的血细胞分类法,目前还无任何仪器可以完全取代。它能够准确地根据细胞形态特征进行分类计数,并可及时发现异常细胞。血液分析仪进行细胞分类主要是从细胞的体积大小、细胞核形、细胞化学染色等方面进行检测,检测速度快,分析细胞多,适宜于大批量标本的分析。对其检测出来的异常标本,要准确识别细胞类别及确认病理改变还必须以显微镜检查为准。

应用意义
在不同的生理状态下,不同种类白细胞数目波动较大。如运动、寒冷、消化期、繁殖期等,此外,在机体失血、剧痛、急性炎症、慢性炎症等病理状态下,白细胞也增多。例如,急性感染、急性中毒、严重组织损伤、恶性肿瘤等中性粒细胞增多;某些病毒、细菌感染、某些慢性感染时,淋巴细胞数量增多。

注意事项
1. 所用玻片必须干净,无油污。
2. 如染色太浅,可按照原来步骤重染;染色太深或有沉淀物则可用甲醇脱色后重染。
3. 如白细胞核为天蓝色则染色时间过短。如红细胞呈紫红色,表示染色时间过长。
4. 染色时切勿使染液干涸,否则发生不易去掉的沉淀。
5. 冲洗时不可先倾倒染色,应先轻轻摇动玻片,缓慢加水使沉渣泛起,然后再用水冲洗。
6. 水冲洗时间不宜过长,否则会脱色。
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