血涂片制作和白细胞分类计数

了解各种类型白细胞的形态特征，掌握血涂片制作方法和白细胞分类计数方法，进行不同鱼类白细胞分类计数和血细胞形态特征、变形率等的观察。

白细胞依据其形状、染色颗粒、细胞质和细胞核的形状大小可以进行分类。通常的分类方法是根据细胞浆中有无特殊的嗜色颗粒，将其分成颗粒细胞和无颗粒细胞。颗粒细胞又依据所含颗粒对染色剂反应特性，被区分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞；无颗粒细胞则分成单核细胞和淋巴细胞。

中性粒细胞有较强的吞噬能力，能将侵入机体的微生物消灭掉，并可参与免疫复合物和坏死组织的清除工作。嗜酸性粒细胞的细胞内含有过氧化物酶和酸性磷酸酶，吞噬能力与中性粒细胞相当或稍弱，能吞噬抗原-抗体复合物，此外，嗜酸性粒细胞具有抗炎作用。

嗜碱性粒细胞含有多种化学物质，如组织胺、肝素和5-羟色胺等，当抗原-抗体发生反应时，或机体在寒冷环境中时，都能引起嗜碱性粒细胞释放组织胺和肝素。血液中的单核细胞穿出血管壁进入组织，变成巨噬细胞，可对抗组织内的致病物，各种细菌和病毒。

淋巴细胞有免疫功能，对异己构型的物质具有杀灭和消除作用。 各种白细胞必须经过染色，才易于区分其类别。常用者为瑞氏（Wright’s）染色法和姬姆萨（Giemsa）染色法。

试剂：

染色液的配制：

1. 姬姆萨（Giemsa）染液的配制

（1）原液配制

Giemsa 粉剂 0.8 g

甘油（医用） 50 ml

甲醇 50 ml

将Giemsa粉剂溶于甲醇中，在乳钵中充分研磨，溶解后再加甘油，混合均匀，置于37～40℃温箱内8～12h，过滤，装入棕色试剂瓶内，密封保存备用。

（2）稀释液

临用时取Giemsa原液5ml，加磷酸盐缓冲液（pH6.4～6.8）50 ml，即为Giemsa稀释液。

（3）pH6.4~6.8磷酸盐缓冲液

取磷酸二氢钾（无水）0.3g，磷酸氢二钠（无水）0.2g，加少量蒸馏水溶解，调整pH至6.4~6.8，加水至1000ml。

2. 瑞氏（Wright′s）染液的配制

（1）原液配制

瑞氏染料粉剂 0.1g

纯甲醇 60 ml

（2）配制步骤：

① 将瑞氏染料粉放人乳钵内，加少量甲醇研磨。

② 将已溶解的染料倒入洁净的玻璃瓶内，剩下未溶解的染料再加入少量甲醇进行研磨，如此反复操作，直至全部染料溶解为止。

③ 装入玻璃瓶内密封，在室温下保存一周即可使用。

④ 新鲜配制的染料偏碱性，放置后呈酸性，染液储存时间越久，染色愈好。

器材：

显微镜，香柏油，载玻片，盖玻片，玻片水平支架，采血针或注射器，计数器，小滴管，蜡笔，消毒棉球，瑞氏染液，pH6.4~6.8磷酸盐缓冲液，姬姆萨染液，蒸馏水。

1. 血涂片的制作：取一滴血（采血方法见实验49），滴于洁净无油脂的玻片一端。左手持玻片，右手再取边缘光滑的另一玻片作为推片。将推片边缘置于血滴前方，然后向后拉，当与血滴接触后，血即均匀附在二玻片之间。此后以二玻片约呈30—45度的角度平稳地向前推至玻片另一端（图一）。推时角度要一致，用力应均匀，即推出均匀的血膜（血膜不可过厚、过薄）。将制好的血涂片晾干，不可加热。

（4）用蒸馏水冲洗（如自来水的pH值稳定于7.2左右时亦可代用）。冲洗血膜时应将玻璃片持平，冲洗后斜置血涂片于空气中干燥。或先用滤纸吸取水分迅速干燥，即可镜检。