聊一聊蛋白纯化都在讨论的质与量
IBA生命科学
无论是出于科研还是工业目的，成功的表达并且纯化所需的蛋白，都是进一步进行分析和研究的基础。在质上和量上有所不同，选择一个合适的纯化系统，来生产并纯化所需质和量的蛋白，值得慎重考虑。一套合适的纯化系统，不仅可以节省时间和成本，更可以节省蛋白样品。
亲和层析法
这种亲和标签针对配体有特殊的亲和力。而配体可以是固定在层析基质上的其他蛋白质，小分子或是金属。当融合有亲和标签的蛋白通过标签-配体作用结合再层析基质上时，通过洗杂步骤，即可去除掉其他的细胞成分。
为了洗脱所需要的蛋白质，通过改变缓冲液的条件，如 pH，或通过竞争亲和标签和配体连接的方法来进行。
-
但怎样的纯化是较为成功的呢？
-
仅达到所需的质量量级，如毫克级（或克级）即可满足吗？
这些并不简单。质在蛋白纯化中同样尤为重要，比如，就蛋白的生物活性和纯度而言，通常会有所要求。以下我们来讨论并且比较 2 种技术：His-tag 系统和 Strep-tag® 系统，都使用了亲和层析法来纯化得到所需的蛋白质，为目前所常用的技术方法。
-
His-tag 系统又很高的蛋白产量（5～40 mg/mL resin），但理想情况下的纯度约为 80% 左右。但如需在随后的分析中测量蛋白质的功能，就需要再进行更多的 cleaning steps；
-
Strep-tag® 系统一步纯化满足的纯度可达到 95%，无需进行更多的纯化步骤即可直接进行蛋白的分析，产量数据为 16 mg/mL。
深度对比 Strep-tag® 与 His-tag His-tag 是以 6 个组氨酸残基组合的融合标签，其基于蛋白质表面的组氨酸残基侧链，在中性和弱碱性条件下可以和固定化的金属离子相互作用（如 Ni 离子，Zn 离子，Co 离子等），从而达到纯化蛋白的目的。
此系统的洗脱方式可以用过三种非特异性步骤达成：① 降低 pH（4.5～6）；② 加入 EDTA；③ 不同浓度咪唑溶液（20～250 mM）。
当蛋白洗脱完毕后，使用 EDTA 使纯化树脂与金属离子分离，即可完成树脂的再生。
Strep-tag® 则是基于链霉亲和素（Streptavidin）和生物素这一自然的相互作用，将 Strep-tag® II（WSHPQFEK）或 Twin-Strep-tag® 作为亲和标签（后者包含 2 个 Strep-tag® II，中间加入 spacer 间隔开来）。
这两种标签都可与改造后的链霉亲和素（Streptavidin）上的生物素结合位点相结合，通过使用脱硫生物素或生物素，即可将 Strep-tag® 标签蛋白洗脱下来。
由于 His-tag 系统具有吸附量大，性价比高，和可以在变性条件下进行蛋白纯化等优点，使其为大众所熟知。而 Strep-tag® 系统则可以获得高纯度的蛋白，但其同时也可以耐受多种缓冲液的使用。下面让我们对二者进行各项数据进行比较：
-
耐受的纯化条件
下表为 His-tag 与 Strep-tag® 系统的耐受缓冲液对比：
如果分离纯化膜蛋白或包涵体时，则纯化过程需要涉及到变性条件。
Strep-tag® 系统最多允许的尿素浓度为 6M，盐酸胍为 1M，而 His-tag 则为 8M 和 6M。如若需要增加蛋白的溶解度，使用去垢剂，则两种系统均可兼容 Triton-X100，Tween 20 和 Nonidet P40。
但不是所有的蛋白过表达后都在包涵体内，且膜蛋白仅占细胞表达蛋白的 20～30%。
因此，如果纯化过程需要考虑特殊的纯化条件，两种系统是都可以选择的。但如果比较其他的常规缓冲液，Strep-tag® 系统则耐受的情况则更理想，其可兼容多种盐溶液，配体，金属离子，以及还原剂和螯合剂。
对比 β-巯基乙醇或氯化钙来说，His-tag 耐受的范围较小。而像 Tris，HEPES 或 MOPS buffer 则不推荐在 His-tag 系统中使用，至于铵，DTT 或 EDTA 则更需避免使用。但 Strep-tag® 系统可耐受以上提及的 buffer 条件，通过配体或金属离子使目的蛋白保持稳定的状态，避免被蛋白酶降解或氧化过程中的损失。
因此 Strep-tag 系统的纯化可以被应用到更多类型蛋白中，如在金属蛋白的纯化。
如果对比两个系统耐受的 pH 值，Strep-tag® 系统则耐受 pH 范围在 4～10，在 pH 敏感蛋白的纯化选择上具有优势。His-tag 系统不应该被使用在低 pH 条件的纯化中，在 pH 4.5～6 的情况下，会导致蛋白的洗脱而造成流失。
-
表达宿主
在生产蛋白质过程中，宿主的选择十分重要，因其不仅影响蛋白的表达，而且也影响随后的纯化过程。除耐受缓冲液条件有限外，当选择宿主表达系统时，His-tag 也有一些局限。
His-tag 大肠杆菌表达系统中较为有利，但实际情况下对于酵母，哺乳动物和昆虫细胞表达系统，尤其是分泌蛋白的纯化中，His-tag 系统则有局限。因为酵母和昆虫细胞的培养基 pH 通常为酸性，会干扰 His-标签蛋白与 IMAC 纯化树脂的结合。而酵母和哺乳动物细胞培养基，则通常含有氨基酸会竞争 His-标签的结合位点，如组氨酸，谷氨酰胺或精氨酸。
Strep-tag® 系统对各宿主表达系统的适用情况较为理想。根据其纯化原理，酸性 pH 和有力的氨基酸不会影响 Strep-标签蛋白与纯化树脂的结合（前文也曾提到，此系统的耐受 pH 范围为 4～10）。而哺乳动物细胞培养基中存在的生物素需要注意，但实际上无需过多担心。因为其可通过添加适当封闭液进行封闭，且在 Twin-Strep-tag®: Strep-Tactin® XT 系统中不会产生影响。
如果考虑使用 His-tag 在酵母、昆虫或哺乳动物细胞中表达蛋白，在成本考量上还需加入后续的实验步骤，根据情况如透析，过滤，尺寸排阻或离子交换色谱等。
因此 His-tag 在量上的优势虽然很明显，但如核算总成本，「多快好省」仍是一种理想。
全面的考虑：
质与量的选择如果在选择纯化系统的选择上仍有疑虑，在下列表格中，全面对比了两种系统的各方面性质，希望可以帮助提供一些参考：
亲和力和特异性，将直接对纯化过程中蛋白挂柱的情况有影响。
His-tag 系统的亲和力仅在 nM-µM 的范围内，会在导致过程中导致蛋白的流失。此外，由于 His-tag 抗体特异性较低，这会导致在使用检测过程中，检测到含有 His 残基的非特异性蛋白。
当进行类似分析等有高亲和力/高特异性抗体需求的实验应用时，如 SPR 或 BLI，Strep-tag® 技术则成为首选，因其 µM-pM 的亲和力范围赋予了较大优势。因此根据需要选择合适的纯化系统非常重要。
此外，由于不同的实验需求，需要多种多样的产品形式。Strep-tag® 系统优点众多，历经长时间的发展，市面上已不仅有纯化填料可以选择，分析类实验的工具也日渐完善。
在各类文献中不难看到的有：标记了荧光染料的 Strep-Tactin® XT 偶联物/抗体，Strep-Tactin® XT 包被板，和适用于 SPR 分析的 Twin-Strep-tag® Capture Kit。
