免疫荧光技术常见问题汇总

1、问：用免疫荧光方法做组织切片和培养细胞内的蛋白，两者操作过程有哪些不同？

参考见解：只是固定方法不同。细胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一样的。

2、问：近期要做免疫荧光双标，不知哪位有免疫荧光双标技术的详细步骤及其注意事项？

参考见解：

（1）选取一抗时要来源于两种不同的动物，可以用来源于 rabbit 和 rat 的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，如 donkey anti-rabbit-FITC（绿）和 donkey anti-rat-Tex-Red（红）。

（2）可以两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗 4 度孵育过夜比较好，背景比较清晰。

（3）阳性对照可以用阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的 IgG，荧光标记物对照是 PBS+ 荧光标记物。

（4）封闭血清与二抗来源动物一致，如 10% 的正常 donkey 血清。

（5）其余步骤同一般免疫荧光单标操作。

3、问：本人拟做 Brdu 标记神经干细胞免疫荧光，二抗为 FITC 标记，想请教各位大侠：

（1）抗体分装和荧光显微镜观察时是否一定要在暗室中进行？

（2）封片时是否用甘油缓冲液即可，还是用甘油和 0.5 mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液等量混合封片？

（3）免疫酶染色中的 3% 过氧化氢及 2N 盐酸是否还需要用？

参考见解：

（1）二抗是用 FITC 标记的，为避免荧光分解，分装及荧光显微镜观察时均要避光；

（2）封片最好用甘油加 0.5mmol/L pH 9.0-9.5 的碳酸氢盐缓冲液，后者能使玻片透明；

（3）关于免疫酶染色，如果是用过氧化物酶做标记，就必须用 3%H2O2 以去除内源性过氧化物酶；2N 盐酸需要使用，目的是使 DNA 变性，让 Brdu 抗体能够充分地与已经掺入的 Brdu 结合。

4、问：做间接法免疫荧光染色，如何设置对照？

参考见解：最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照，看是否非特异性染色。

（1）空白对照：如果你做的是石蜡切片免疫组化，这个对照必须有，目的是看自发荧光，脱蜡后直接在荧光显微镜下观察。

（2）阴性对照：标本直接滴加二抗，呈阴性反应。

（3）抗原对照：标本加同种动物的未免疫血清，以 PBS 冲洗后，在加抗免疫球蛋白荧光抗体。因未免疫动物的血清中无特异性抗体，应呈阴性反应。

5、问：做乳腺组织的免疫荧光染色，结果用激光共聚焦显微镜看很好：有阳性信号，阴性对照组也没有荧光，但是拿到荧光显微镜下看，我的阴性对照组一片绿，像非特异性染色，到底哪个结果才是真实的呢？

参考见解：激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高的多，出现上述现象首先要排除荧光显微镜的问题，如是不是紫外灯泡寿命到期了或者别的原因，荧光显微镜没有问题，那就以共聚焦显微镜的结果为主。