Cell Metab：西京医院王琳教授团队报道非酒精性脂肪肝炎新靶点
丁香学术
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随着人们饮食和生活习惯的改变，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）已逐渐成为世界范围内最常见的慢性肝病 (1)。如果没有得到有效的治疗，NAFLD 可能发展为非酒精性脂肪性肝炎（NASH），这可能进一步导致一系列代谢紊乱甚至肝癌的发生 (2)。
尽管医疗需求迫切，但目前几乎没有药物获批用于 NASH 的治疗 (3)。因此，进一步探索 NASH 进展的分子机制，以确定潜在的治疗靶点显得至关重要。
2021 年 6 月 18 日，来自第四军医大学西京医院的王琳、窦科峰教授团队在 Cell Metabolism 上在线发表了题为 Tripartite motif 16 ameliorates nonalcoholic steatohepatitis by promoting the degradation of phospho-TAK1 的研究成果 (4)。该研究发现 E3 泛素连接酶 TRIM16 通过促进 p-TAK1 的泛素化依赖性降解，改善 NASH 进展过程中的脂质积累和炎症。
图片来源：Cell Metabolism
研究内容
肝细胞的脂肪毒性诱导 TRIM16 的表达
脂肪毒性是脂质过度积累的结果，在 NASH 进展中有着重要作用 (5)。在本研究中，作者主要希望关注这一过程中的泛素化相关分子。
作者首先用棕榈酸和油酸（PAOA）处理肝细胞，以建立一个脂肪毒性的细胞模型，并通过 RNA-seq 技术筛选差异表达的基因。作者筛选到了 4 种 E3 泛素连接酶，其中 TRIM16 的表达差异最为显著。细胞和动物实验也证实，TRIM16 会被脂肪毒性诱导表达。因此，作者选择 TRIM16 进行更加深入研究。
图片来源：Cell Metabolism
那么，TRIM16 在脂肪毒性中发挥了怎样的作用呢？作者在原代肝细胞中过表达 TRIM16，发现 PAOA 处理导致的脂质累积得到显著缓解。在小鼠模型中，特异性敲除肝细胞 TRIM16，会加重高脂饮食诱导的肝脂肪变性，并加剧高脂高胆固醇饮食诱导的 NASH 的发生。
TRIM16 抑制 NASH 中 JNK-p38 信号通路
TRIM16 又是通过什么样的机制影响 NASH 的呢？考虑到 TRIM16 是一种 E3 泛素连接酶，作者进行了转录组学和泛素组学的联合分析，来探索 TRIM16 发挥功能的潜在通路和下游靶标。
对转录组数据进行富集分析发现，TRIM16 过表达显著调控了多条通路，其中 MAPK 信号通路富集得分最高。泛素组学分析也显示，TRIM16 主要调控 MAPK 信号通路中的相关分子。
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MAPK 信号通路有多种分支类型，其中主要包括 ERK、JNK 和 p38 等等。作者通过 western blot 分析证实，在 PAOA 处理的肝细胞中，过表达 TRIM16 可抑制 JNK1/2 和 p38 的激活，反之亦然，但 ERK1/2 的磷酸化没有受到影响。这些结果表明在 NASH 中，TRIM16 可抑制 JNK-p38 通路的激活。
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TRIM16 促进磷酸化的 TAK1 的蛋白酶体降解
TRIM16 又是如何抑制 JNK-p38 通路激活的呢？
为了确定 TRIM16 抑制 JNK-p38 通路的具体靶点，作者在肝细胞中过表达 TRIM16，并进行了免疫沉淀 - 质谱（IP-MS）分析。通过整合 IP-MS 和定量泛素组学的结果，作者筛选到 3 个 MAPK 通路成员，其中 TAK1（也叫 MAP3K7）已被证实在 NASH 进展过程中发挥关键调控作用，因此作者选择 TAK1 进行了进一步的研究。
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免疫共沉淀试验和泛素化试验证实 TRIM16 可与 TAK1 相互作用，并介导其泛素化的发生。更加细致的分析发现，突变 TAK1 第 282 和 547 号位上的赖氨酸（K282 和 K547），可消除了 TRIM16 介导的泛素化，提示 K282 和 K547 是 PAOA 处理下 TRIM16 催化 TAK1 泛素化的特定位点。
接下来，作者研究了 TRIM16 催化的泛素化对 TAK1 的影响。作者发现在过表达 TRIM16 的肝细胞中，磷酸化的 TAK1（p-TAK1）减少，反之亦然。然而，令人惊讶的是，总 TAK1 水平保持不变。因此作者猜测，TRIM16 可能主要促进 p-TAK1（而不是总 TAK1）的蛋白酶体降解。在使用蛋白酶体抑制剂 MG132 处理后，TRIM16 对 p-TAK1 的抑制作用消失了。
图片来源：Cell Metabolism此外，在使用 5Z-7 选择性地减弱了 TAK1 的磷酸化后，TRIM16 和 p-TAK1 的相互作用被显著削弱。进一步地，作者将 TAK 的 4 个磷酸化位点（T184、T187、S192 和 S412）分别用丙氨酸（TAK1-4A，模拟去磷酸化）或天冬氨酸（TAK1-4D，模拟磷酸化）替代，发现 TAK1-4A 与 TRIM16 仅表现出微弱的相互作用，而 TAK1-4D 与 TRIM16 的相互作用增强。泛素化试验也与这一结果相符。
接着，作者通过动物模型验证了 NASH 进程中的 TRIM16-TAK1 信号轴的作用。作者发现通过 5Z-7 抑制 TAK1 磷酸化，可以消除 TRIM16 缺失导致的 NASH 恶化，进一步表明在 NASH 中，TRIM16 通过调控 p-TAK1 而发挥细胞保护作用。
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最后，作者探究了 TRIM16 在 NASH 治疗中的效果。作者将表达 TRIM16 的腺相关病毒 8（AAV8）注射到高脂高胆固醇喂养的小鼠中，并继续以这样的饮食喂养 8 周。结果发现，TRIM16 过表达显著缓解了小鼠肝脏中的脂质积累、炎症、纤维化和肝损伤的情况。
研究总结
在本研究中，作者整合多组学分析，筛选得到 E3 泛素连接酶 TRIM16 作为减轻 NASH 的候选分子。
作者发现 TRIM16 过表达可以缓解小鼠 NASH 模型中的脂质积累和炎症，而 TRIM16 缺失会加重脂质积累和炎症。
机制上，TRIM16 促进了 p-TAK1 的泛素化降解，进而抑制 MAPK 信号通路的激活来抑制 NASH 进展。
总之，这些结果提示 TRIM16 可能作为 NASH 的一个潜在的治疗靶点。
图片来源：Cell Metabolism
参考文献
1.A. J. Sanyal, Past, present and future perspectives in nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 16, 377-386 (2019).
2.Z. M. Younossi et al., Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes. Hepatology 64, 73-84 (2016).
3.Z. Chen, Y. Yu, J. Cai, H. Li, Emerging Molecular Targets for Treatment of Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Trends Endocrinol Metab 30, 903-914 (2019).
4.L. Wang et al., Tripartite motif 16 ameliorates nonalcoholic steatohepatitis by promoting the degradation of phospho-TAK1. Cell Metabolism, (2021).
5.S. Schuster, D. Cabrera, M. Arrese, A. E. Feldstein, Triggering and resolution of inflammation in NASH. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 15, 349-364 (2018).
题图来源：站酷海洛 Plus
