我该给小鼠找啥样的对象，他们才愿意生？

之前承诺大家的小鼠「干货」已经出炉啦。上期不少同学留言表示想了解基因修饰小鼠相关的知识，这次我们把转基因、基因敲除、基因敲入、条件性基因敲除繁育方案给一次性讲透，教会大家如何正确地给小鼠找对象，组织好这场「包办婚姻」。

转基因

这里说的转基因，并非广义上的所有的基因修饰，而是特指外源基因随机地整合到小鼠染色体上获得的随机插入转基因小鼠。

通过受精卵显微注射的方式，通常我们会获得很多个带有外源基因插入的首建鼠（Founder）。每一个首建鼠，外源基因插入的位置或次数都是不同的。所以每个首建鼠都应该自成一系，也就是我们说的建系。

每一个 Founder 鼠分别与野生型（WT）小鼠（比如，常用的 C57BL/6J）交配，获得的 F1 子代；经过鼠尾基因型鉴定后，F1 代中的阳性小鼠保留并再与野生型小鼠交配，获得 F2 子代；F2 代阳性小鼠保留再与野生型小鼠交配，获得 F3 子代；以此类推。一个 Founder 鼠产生的子代，称为一个系。一般以 Founder 鼠的编号命名，比如：3 号 Founder 获得的后代阳性小鼠，称为 3 系。

F1 代中可能出现一窝小鼠没有一只是阳性的情况。这是由于外源基因的整合可能发生在多细胞期，导致 Founder 小鼠中并不是所有细胞（包括生殖细胞）都有外源基因的整合，而是呈嵌合状态。先别急着扔掉这个 Founder 鼠，因为它仍然有可能是个阳性的 Founder，可以再试着多配几窝。除非你的 Founder 鼠多到用不完... Lucky you！

基因敲除/敲入

对于采用 ES 细胞打靶途径获得的基因敲除（KO）小鼠，在 Flp 重组酶去除 Neo 抗性基因以后，可以通过 KO 杂合子（+/-）之间相互交配的方式获得 1/4 KO 纯合子小鼠（-/-）、1/2 KO 杂合子小鼠（+/-）以及 1/4 同窝野生型对照小鼠（WT）。繁育流程如下图所示：

该路径同样也适用于基因敲入（KI）小鼠。

需要指出的是，对于利用 CRISPR/Cas9 介导的 NHEJ 途径获得的 KO 小鼠，情况有所不同，方案类似于转基因小鼠的繁育。由于 NHEJ DNA 修复的结果是随机发生的，所以每一只 KO Founder 小鼠、甚至一只 Founder 中每个细胞的基因型都可能是不同的。因此，KO Founder 要与野生型小鼠（比如：C57BL/6J）交配，获得基因型明确的 F1 子代 KO 杂合子（+/-）小鼠。随后，才能进行杂合子小鼠的相互交配。

条件性基因敲除

Flox 小鼠在去除 Neo 基因以后（CRISPR/Cas9 途径获得的 CKO 小鼠省略此步骤），获得仅含有两个 loxP 位点的 flox 杂合子小鼠（flox/+，可缩写成 f/+）。 flox 杂合子（f/+）小鼠与组织特异性或诱导型 Cre 阳性（Cre+）小鼠交配，获得 flox 杂合同时带有 Cre（f/+；Cre+）的小鼠，再与 flox 杂合子（f/+）交配，这样最终可以获得 1/8 的 flox 纯合且带有 Cre 的条件性基因敲除小鼠（f/f；Cre+）。

是不是觉得 1/8 的比例太低了？那可以用下面的方法，轻轻松松将效率提高一倍。很简单，在繁育 f/+；Cre+ 的同时，繁育 flox 纯合子（f/f），再将这两种小鼠相互交配。这样，就可以获得 1/4 的 f/f；Cre+ 敲除小鼠啦。