3 年免疫共沉淀经验总结

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。它可以：

1. 测定两种目标蛋白质是否在体内结合；

2. 确定一种特定蛋白质的新的作用搭档；

3. 分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

实验原理

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质 X 的抗体免疫沉淀 X，那么与 X 在体内结合的蛋白质 Y 也能沉淀下来。

目前多用精制的 prorein A 预先结合固化在 argarose 的 beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads 上的 prorein A 就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

实验步骤

一、试剂准备

二、免疫共沉淀反应

1. 转染后 24～48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解 30 min，细胞裂解液于 4 °C，最大转速离心 30 min 后取上清。

2. 取少量裂解液以备 Western blot 分析，剩余裂解液加 1 μg 相应的抗体加入到细胞裂解液，4 °C 缓慢摇晃孵育过夜。

3. 取 10 μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗 3 次，每次 3 000 rpm 离心 3 min。

4. 将预处理过的 10 μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中 4 °C 缓慢摇晃孵育 2～4 h，使抗体与 protein A 琼脂糖珠偶连。

5. 免疫沉淀反应后，在 4°C 以 3 000 rpm 速度离心 3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用 1 ml 裂解缓冲液洗 3～4 次；最后加入 15 μl 的 2 × SDS 上样缓冲液，沸水煮 5 分钟。

6. SDS-PAGE，Western blotting 或质谱仪分析。

三、通过免疫共沉淀确定结合蛋白

1. 用磷酸盐缓冲液洗 30 块 10 cm 培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到 1 ml 冰冷的 EBC 裂解缓冲液中。

2. 将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上 4 ℃ 以最大速度离心 15 min。

3. 收集上清（约 30 ml）并加入 30 μg 的适当抗体，4 ℃ 摇动免疫沉淀物 1 h。

4. 加入 0.9 ml 的蛋白质 A-Sepharose 悬液，4 ℃ 摇动免疫沉淀物 30 min。

5. 用含 900 mmol/L NaCl 的 NETN 洗蛋白 A-Sepharose 混合物，再重复洗 5 次。最后，用 NETN 洗一次。

6. 吸出混合物的液体部分。加入 800 μl 的 1×SDS 胶加样缓冲液到球珠中，煮沸 4 min。

7. 将样品加入到大孔的不连续 SDS-PAGE 梯度胶中，在 10 mA 的恒定电流下电泳过夜。

8. 通过考马斯亮蓝染色观察蛋白质泳带。

9. 从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用 1 ml 50% 乙腈洗两次，每次 3 min。

10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。

11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在 ABI 477A 或 494A 机器上进行自动 Edman 降解测序。