你的 SSR PAGE 胶为啥扩不出条带？ | 实验时间

当年阴阳师大火的时候，第一次听身边的朋友说起抽 SSR，心里一惊：难道这玩意儿还能抽？后来明白，此 SSR 非彼 SSR，实验狗说到的 SSR 是这样的：

简单重复序列（Simple Sequence Repeat,SSR）也被成为微卫星 DNA，根据其两端互补序列设计引物，通过 PCR 反应扩增微卫星片段，由于核心序列的串联重复数目不同，所以能够用 PCR 的方法扩增出不同长度的 PCR 片段，将这些片段进行凝胶电泳，根据分离片段的的大小确定所研究生物基因的基因型，可以计算出等位基因的基因频率。

我们的 SSR 有很多优点呀，比如在真核生物基因组中分布较为广泛（植物中平均每 20~30 Kb 就会出现一个SSR）、可以轻松鉴别纯合子杂合子（微卫星共显性遗传）、所需 DNA 量较少（单位以 ng/ul 计）、成本较低等。

我们实验室即是采用图位克隆的方法，对模式生物——水稻进行基因定位与克隆的。

我们分离 PCR 产物用的是 8% 的丙烯酰胺凝胶电泳，一直效果不错，新生刚来的时候，就是从学习提水稻 DNA、扩 PCR、跑 SSR PAGE 胶（俗称「跑槽」，233333）开始进行基因的图位克隆的。

理想的情况应该是染色洗净后的胶面上，背景干净、marker 清楚、亲本+极端个体的每个条带清晰明亮，不会对读数据有任何影响的。然而这仅是理想状态，对新进实验室门的准研究生尤其是硕士生来说，跑出干净明亮的条带甚至跑出条带，都是一件无比期盼的事。所以今天想分享一下，作为新生，SSR PAGE 胶跑不出条带的时候，该怎么解决？

图片来源：站酷海洛 plus

首先要做的，一定是仔细观察染色后全部 PAGE 胶的胶面，跑不出条带会有以下几种情况：

1、 整个胶面「干净无比」，什么都没有，没有 Marker、没有亲本、没有极端个体，光洁如镜到怀疑人生。这时候可能就需要考虑，是不是电泳槽或者胶做得有问题了：

Ø 当出现有的胶面没有条带、有的胶面条带正常显示的时候，说明少数的电泳槽可能出现了问题，而用槽的时候刚好踩到了这几颗雷，那就没办法了，按流程把没跑出条带的这些样品重新扩 PCR、换电泳槽来重新跑就是了；

Ø 当出现所有胶面全部没有条带的时候，可能会怀疑 PAGE 胶做的有问题。我们的 PAGE 胶的成分是：去离子水、TBE、8% 丙烯酰胺（+甲叉丙烯酰胺）、10% 过硫酸铵溶液（AP）和 TEMED，这个时候可能某种试剂出现了问题，比如 TBE 浓度配得太低、丙烯酰胺出了差错，等等，需要改换合适的试剂或者自己配制（实验室有一次公共的丙烯酰胺配错了。坑了好一堆人，都是泪啊），重新跑胶。

2、 胶面上有清楚明亮的 Marker，但是亲本+极端个体的条件都没有出现。Marker 的出现表明电泳槽和 PAGE 做得都没有问题，就要从扩好的 PCR 原液上找原因了：

Ø 有的胶面有 Marker、亲本+极端个体带件正常，有的胶面只有 Marker，亲本+极端个体都显示不出来。这个时候我一般会怀疑，扩 PCR 的 PCR 仪出现了问题，一部分 PCR 仪工作正常，而那些扩不出来的样品踩到了出了毛病的 PCR 仪的雷上，就出现了这样的结果，OK，换好用的 PCR 仪就是了（要保证扩增程序没问题）；

Ø 所有的胶面都只有Marker，一概没有亲本+极端个体的条带，这时候我可能会想，是不是 PCR 体系中出现了错误。PCR 体系分两边来想，一个是 DNA+引物，一个是去离子水+Buffer+dNTP+rTaq 酶。DNA 在提好之后必然会检测它的浓度、观察峰值和曲线，如果都比较理想的话，一般不会有什么事（不放心可以扩个水平的琼脂糖胶检测一下）；

在基因的连锁阶段，引物是全实验室通用并统一保管的，若出现了问题，肯定是大家都跑不出条带的，如果是自己分装的，注意看一下是不是在常温环境放太久，引物失活了；一般去离子水不予考虑，dNTP 加足量即可（当然我们会 2-3 倍量地加进体系中，怎么会不够呢？）；

Buffer 注意看是否加入了 Mg2+（曾经有一段时间，实验室买的 Buffer 是需要另加 Mg2+的，然而大家都没有注意到，一个大组的人在 SSR PAGE 上连跪好几天）；

最后是 rTaq 酶，其实这个酶的活性还是比较好的，平常 -20℃冰箱存放，拿出来用的时候打点冰放冰上就 OK 啦。

图片来源：站酷海洛 plus

Ø 最后的小 Tips 是，样品放进 PCR 仪之前，仪器的样品孔和热盖温度都是常温的，程序设定第一步 95℃ 它会有一个升温过程，这个时候别着急稍放样品，微等一下，等 PCR 仪到了 70-80℃，再赶快把样品放进去，盖上盖子。可以减少升温过程对 rTaq 酶的损耗。

3、 胶面上有清楚明亮的 Marker，亲本也清楚单一，但是极端个体的条件没有出现，整个 PAGE 胶看起来和筛多态似的（2333333）。只要有除了 Marker 之外的条带出现就好办多了，充分说明现在：电泳槽 OK、PAGE 胶OK、PCR 仪 OK、扩增 PCR 的混合物体系 OK、公用引物 OK，只剩最后一个敌人：

Ø 某些样品的 DNA 质量。提 DNA 这种技术活，还是请自己实验室的师兄师姐多教多学多练习去吧，能说的无非就是，植物样品的话，叶片比种子好提多了，质量效果也棒，能发苗提叶片 DNA，就不要按着种子不放了。

Ø 极少数极少数会出现某些引物与 DNA 结合效率较低或有选择特异性的情况，提高了样品 DNA 质量和浓度、改变了引物浓度、尝试了不同退火温度之后仍然无果，现在在要求不高、公用引物很多、尚且还在基因连锁的阶段，怎么办呢，建议你：

换引物。

换好用的引物。

这是多么明智的选择啊！

4、 还有的时候偶尔会有这样的情况，比如：

Ø 条带都还正常，就是染色出来颜色过浅或者过深，想想是不是银染的时候第一次漂洗没有用去离子水（自来水中有 Cl—，会结合 Ag+ 生成沉淀、带走 Ag+）、漂洗次数过多（最好不要超过 2 次就够啦）、碱性溶液中的甲醛是不是滴加的多了少了；

Ø 整个胶面背景比较脏，杂带很多，要不要稍微提高一点点 PCR 程度中的退火温度、或者减少一点点 rRaq 酶的用量、或者样品的模板 DNA 浓度降低一丢丢（DNA浓度在 30-80ng/ul 之间比较合适，太高了也会有很多杂带）？

分子实验一般是结果导向的，根据结果找原因，多数的原因应该大致就像这样了。要是你的 SSR PAGE 的条带这些原因都排除了还是扩不出来，我觉得就去可以庙里烧个香了，因为我进实验室门的时候，师兄带着微笑脸对我说：

师妹呀，常心怀敬畏——实验室上方三尺有神明。