RT-PCR 没有产物怎么办？

在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有 RT-PCR 产物，可能有以下原因。

RNA 被降解

在用来验证完整性之前先在变性胶上分析 RNA。使用良好的无污染技术分离 RNA。在将组织从动物体取出后立刻处理。在 100％ 甲酰胺中储存 RNA 如果使用胎盘 RNase 抑制剂，不要加热超过 45℃ 或 pH 超过 8.0，否则抑制剂或释放所有结合的 RNase。而且，在≥0.8 mM DTT 时加入 RNase 抑制剂，一定要存在 DTT。

RNA 中包含逆转录抑制剂

通过乙醇沉淀 RNA 除去抑制剂。用 70％（v/v）乙醇对 RNA 沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25 μg 到 0.4 μg/μl）以帮助小量样品 RNA 的恢复。

逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐。将对照 RNA 同样品混合，同对照 RNA 反应比较产量以检验抑制剂。

多糖同 RNA 共沉淀

使用氯化锂沉淀 RNA 以除去多糖。用于合成 cDNA 第一链合成的引物没有很好退火。确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在 25℃ 保温 10 分钟。对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他 GSP，或换用 oligo(dT) 或随机六聚体确定 GSP 是反义序列。

起始 RNA 量不够

增加 RNA 量。对于＜50ng 的 RNA 样品，可以在第一链 cDNA 合成中使用 0.1 μg 到 0.5 μg 乙酰 BSA。

RNA 模板二级结构太多

将 RNA 和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火。提高逆转录反应温度，对 SuperScriptⅡ可以到 50℃，对 ThermoScript 可以到 65℃。

注意：不要在＞60℃ 时使用 oligo(dT) 引物，选择一个在反应温度可以退火的 GSP。对于＞1kb 的 RT-PCR 产物，保持反应温度≤65℃。不要在高于 37℃ 时使用 M-MLV。如果不需要全长 cDNA，在第一链反应中使用随机引物。

引物或模板对残余的 RNA 模板敏感

在 PCR 前用 RNaseH 处理。靶序列在分析的组织中不表达 尝试其他靶序列或组织。PCR 没有起作用 对两步法 RT-PCR，不要在 PCR 步骤中使用超过 1/5 的逆转录反应产物

PCR 引物设计太差

避免在引物 3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计 Tm 类似的引物。DNA 含有抑制剂 诸如 DMSO，SDS 和甲酰胺之类的试剂会抑制 Taq DNA 聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀 DNA。

富含 GC 的模板 对于 GC 含量＞50％ 的模板，使用 PCRx Enhancer Solution。模板浓度太低 使用 10^4 拷贝的靶序列，以在 25 到 30 个循环中获得信号。

镁离子浓度太低 从 1 mM 到 3 mM，间隔 0.5 mM 进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量 PCR，使用 3 mM 到 5 mM 的镁离子浓度。

退火温度太高 使用公式估算 Tm，把退火温度设定为低于 Tm 5℃。因为这些公式只是估算 Tm 值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。