不需要探针就能做突变分析？

如果你做过序列差异分析，就会发现常用的方法包括单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、变性高效液相色谱、测序等，这些方法都需要分离样品。之后进行多步反应，操作繁琐，耗时长，且 PCR 产物有污染的风险。而 HMR 在 5 分钟之内就能完成，无需额外的步骤，也容易开发成高通量筛选，且是唯一的闭管操作，增加了分析的可靠性，这些优势对于分子诊断分析而言，格外重要。

如果你做 DNA 甲基化，HRM 分析还为你另辟蹊径。DNA 样品通过亚硫酸氢盐的处理，将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶。这样，原先未甲基化模板所产生的 PCR 产物比甲基化模板的 Tm 要低。HRM 还能确定特定样品中甲基化的比例。将不同比例的甲基化和未甲基化 DNA 混合，制作出标准曲线，将样品的熔解曲线与之相比较，从而确定样品中甲基化的比例。

HRM 是不是很熟悉？它就是高分辨率熔解（High-resolution melting）分析技术，SNP 分型技术之一。它仅仅通过 PCR 之后的熔解曲线分析，就能检测 PCR 片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、序列配对和基因分型等多个方面。

其实双链 DNA 的熔解分析可追溯到上世纪六十年代，当时是通过紫外吸收来监测的。分析需要几微克的 DNA，而样品以 0.1-1.0 度/分钟的速率缓慢加热，常常要花上几个小时才能完成。后来，LightCycler 定量 PCR 仪的出现，让荧光熔解分析变得流行。样品量因毛细管而缩减至纳克级，且熔解速率更快，达 0.1-1.0 度/秒，这样熔解时间缩短至几分钟。当时使用的染料是 SYBR® Green I。

然而，这种熔解分析只能区分在片段大小和 GC 含量上差别较显著的 DNA 序列，比如检查 PCR 扩增产物中是否存在引物二聚体及其他非特异性的扩增。如果要区分 SNP，分辨率还不够。为什么呢？这里有必要先介绍一下饱和染料和非饱和染料。SYBR Green I 就属于非饱和性染料，由于它对 PCR 的抑制作用，在实验中的使用浓度很低，远未将 DNA 双螺旋结构中的小沟饱和。这样，DNA 双链高温变性时，单链部分的荧光染料分子发生重排，荧光染料分子重新结合到双链 DNA 的空置位点，造成荧光信号没有变化，因此出现假阴性，特异性下降。

于是，饱和染料问世了。它们即便在饱和浓度（荧光最大）下，也不会抑制 PCR。故高浓度的染料饱和了 DNA 双螺旋结构中的小沟，在 DNA 解链过程中就不会发生重排，这样熔解曲线才有了更高的分辨率。目前市场上的饱和染料主要有 EvaGreen、LC Green、LC Green Plus、SYTO 9 等几种。光有染料还不够，仪器也要相应升级呢。

扩增子的熔解曲线完全取决于 DNA 碱基序列。序列中如有一个碱基发生了突变，都会改变 DNA 链的解链温度。但是这个差异极小，只有零点几摄氏度，如果仪器的分辨率不高，是根本无法检测的。那么什么样的分辨率才是高分辨率呢？根据仪器现有的功能测试，在熔解操作时每摄氏度至少要获得 10 个数据点，这是对仪器的最低要求。此外，温度均一性也同样重要。如果两孔之间温度相差 0.1 度，就很可能导致最终的熔解温度相差 0.1 度，这样就无法保证 HRM 分析结果的准确性。大多数常规定量 PCR 仪的孔间温度差在 0.3-0.5 度，这也决定了它们无法胜任 HRM。

在拥有饱和染料和高分辨率仪器之后，HRM 分析就可以开始啦。这个过程其实很简单，就是对 PCR 的扩增子进行加热，温度从 50 度逐渐上升到 95 度。在此过程中，扩增子逐渐解链，在到达熔解温度（Tm）时，DNA 链完全分开。在 HRM 分析的初期，荧光强度很高，随着温度升高，双链 DNA 逐渐减少，荧光强度也就下降了。HRM 仪器通过照相机，记录下荧光变化的整个过程。通过对数据的作图，就生成了熔解曲线。

果然够简单吧，连探针也无需设计，只要在常规 PCR 中加一个饱和染料即可。HRM 既可以对未知突变进行筛查、扫描，也可以对已知突变进行分析。相对于传统的突变分析而言，操作步骤大大简化，时间和成本也降低了不少。而且样品经 PCR 扩增后直接进行 HRM 分析，无需转移，真正实现了闭管操作，降低了污染的风险。