想要 PCR 不踩「坑」，学会这 3 招就对了...

PCR 是一个坑，坑里埋了好多研究僧……

PCR 是众位「研究僧」日常实验中最常用的技术，可谓是「研究盛宴」中的一道「小菜」。可也有不少童鞋反映，这道菜不好吃，一不小心就「小河里翻船」。

那么，我们该如何把这道菜「吃好」、跳出这个「坑」呢？

诸位看官莫急，待我送君「三大法宝」。

一、确保 RNA 样本合格

常见的 RNA 提取方法有 TRIzol 法、吸附法，这两个方法各有所长，但都不能保证提取的 RNA 样本一定合格。

因而，提取完成后应测定 RNA 的浓度及吸光度。通常，在 260，280，230 nm 处分别测定其吸光度（A260、A280、A230）并计算其比值（A260 /A280，A260 /A230）。

那么，这几个数值及其比值分别有何意义？

A260 为核酸的吸光度，A280 为蛋白质的吸光度，A230 为其他杂质（多糖等）的吸光度。纯 DNA 的 A260 /A280 为 1.8，纯 RNA 的 A260 /A280 为 2.0。

如果 OD 比值不在范围内该如何解决呢？

再次洗涤样本！

75% 乙醇沉淀 RNA 后重新吸附、洗涤；若采用 TRIzol 法提取 RNA，可直接洗涤两次。洗涤后离心时可两次分别将 EP 管置于不同的方向，便于彻底洗涤 RNA 样本。通常洗涤两次后可使测得的 OD 值较为理想。

二、 利用「RNAstructure」软件

引物，是进行荧光定量实验的必备条件。其特异性的问题可通过「BLAST」搞定，让人比较头痛的是引物可以形成「发夹结构」或「二聚体」（即在＜75℃ 时出现溶解曲线的峰），影响扩增效率，最终导致实验结果不可用。

那么，这个问题能否解决呢？

有！设计引物的时候用「RNAstructure」预测一下引物的二级结构即可。

那么，这个软件要如何使用呢？

1. 打开「RNAstructure」，单击左上角的「new sequence」按钮：

2. 新建序列文件，会出现一个对话框，输入待检测的引物序列：

3. 单击「Fold as DNA」，「save changes」，出现新的对话框后直接点击「Start」：

4. 无需更改其他参数，再次点击「Draw structure」，即可得到目标序列的二级结构：

• 若考察引物能否形成发夹结构，则直接检测 Forward 或 Reverse 引物即可。

• 若考察引物能否形成二聚体，则把两条引物一起输入，视作一条序列进行检测即可。

在得到二级结构图后，只要没有连续 4 个以上的配对即可；若一条引物长度为 20 bp，在 18～22 处有连续 5 个的碱基配对，则可「手动拆解配对」，即保证引物为两条链时的配对不多于 4 个即可。

三、保证扩增效率符合要求

有童鞋反映，两个同类基因测试同一批样本，理论上趋势应该一致，结果却是两种趋势，应该相信哪个呢？

不知道各位看官有没有遇到类似的问题？这类问题该如何解决呢？

先说说出现这类问题的原因吧：

1. 扩增条件非最佳；

2. 样本中含有抑制扩增的物质，如乙醇。

一对引物有其特定的 Tm 值，但 Tm 值时未必是其最佳扩增温度。温度过高时，扩增效率过低，差异部分的目的基因不能被扩增，导致「假阴性」结果的出现。

那么，如何确定扩增效率是否满足要求呢？

通常，拿到新引物后应从 Tm- 5℃ 寻找其适宜的扩增温度，在某温度起为特异性扩增。

然后，在特异性扩增的温度下检测扩增效率：将 cDNA 梯度稀释（一般为 2×），测试稀释后的样本 Ct 值差异是否为 1 左右。

• 若差值为 1，则扩增效率良好，可进行正式实验。

• 若在特异性扩增的温度范围内不能使 Ct 值差异为 1，则需考虑重新设计引物。