蛋白质结构与功能研究技术路线

蛋白质参与行使几乎所有的细胞功能。为了行使其特定的功能，蛋白质必须折叠成特定的结构。蛋白质结构研究可帮助对其功能机制的深入理解，也可帮助进行药物筛选及设计优化。

蛋白质生物化学功能主要有结合、催化、分子开关以及细胞骨架等。哺乳动物细胞中蛋白质超过一半是酶。

蛋白质结构的稳定性是其发挥生物功能必需的，三级结构由非共价和共价两类相互作用稳定，其中非共价相互作用为主。

下表是稳定蛋白质结构的化学相互作用。

蛋白质结构的柔性是其发挥功能必需的：蛋白质结构柔性对于其配体结合和催化是必需的；蛋白质三级结构的柔性使其能够对配体进行调适；不同蛋白质根据其功能具有不同程度的结构柔性。值得注意的是蛋白质晶体结构是时间和空间的平均，是静态的，而生理条件下蛋白质结构往往是一个巨大的构象集合，是动态性的。

分子识别和催化均依赖于结构互补性，分子识别依赖于蛋白质三级结构形成的特定微环境，而催化反应则依赖于结合位点的特定微环境。蛋白质结合生物大分子的位点位于蛋白表面上，形状可为凹，凸或平，而蛋白质结合小分子的位点通常是裂缝，口袋或洞；催化位点通常位于结构域或者亚基界面上。配基结合位点通常具有更多的疏水残基暴露在分子表面；小分子结合位点通常是凹陷的并具有部分疏水性；以疏水补丁为主介导的弱相互结合使得蛋白可以交换伙伴 (信号转导)；决定结合力的结构元素通常是不具有方向性的疏水相互作用；决定结合特异性的结构元素通常是具有方向性的，如氢键等。

鉴定蛋白质结合位点的策略：蛋白质结合位点有时候可通过对其三维结构的计算分析得到 (GRID/MCSS)。实验方法测定蛋白质结合位点比计算分析准确，定点突变可以鉴定与结合或催化相关的氨基酸，DOCK 可以模拟蛋白质与配体之间的结合（点此查看分子对接教程）。

蛋白质是由单个或多个结构域组成的，结构域 / 折叠花样的总数是有限的。蛋白结构的模块化本质允许一级序列存在插入或删除。一般来说，结构域与功能一一对应（如 Kinase），但并不总是如此（如 TIM 桶），类似的结构可具有不同的功能 , 不同的结构可具有相似的功能。

蛋白质结构与功能研究的技术路线如下：

对整个技术路线，我们挑选其中的几个来讲一讲。首先就是蛋白结晶片段的选取，前面讲过，一般来说，蛋白质结构域与功能一一对应。因此，为了降低整个项目的难度（多个结构域会增加蛋白制备难度和结晶难度），通常会按照结构域选取蛋白质片段进行重组蛋白制备及结晶。这就涉及到蛋白质结构域边界如何确定的问题。目前的主要方法是限制性酶解：比如将重组蛋白与 trypsin 孵育，取不同孵育时间的样品进行 SDS-PAGE 鉴定。一般来说，独立的结构域具有结构上的稳定性，能抵抗住蛋白酶酶解作用，这样我们从 SDS-PAGE 图上就可以观察到一条稳定条带，然后通过质谱、N 端测序等手段确定该片段的起始 - 终止位置。然后就以这个片段构建克隆，制备重组蛋白，进行后续的一系列实验。

在完成蛋白质结构测定之后，就需要对蛋白质结构进行分析。通过结构，我们可以找到酶的活性位点、分子表面电荷与形状、与配体相互作用界面以及构象变化。这些特征为我们了解功能作用模型和生理与病理机制提供了可能。基于上述结构特征，我们可以提出假说性的分子机制，然后基于结构分析的突变与野生型对比，我们可以对机制进行修正和完善。具体来说，我们可以对突变型和野生型进行生化分析（活性及相互作用）；细胞学分析（活性及相互作用对定位及细胞表型影响）；遗传学分析（果蝇或小鼠表型变化及相关信号通路）。