如何用 R 语言绘制火山图？

测序技术的火爆程度，大家有目共睹，做了测序就一定会涉及差异分析的表达，差异分析最常用的就是「火山图」和「热图」了。

看看这两种图形在顶级期刊中的出场率！

图片来源：各期刊截图

这两种图形最常用的是用 R 语言绘制，但很多人不知道 GraphPad prism 软件同样也可实现。

今天，我们就两种图形的 R 语言和 GraphPad prism 画法进行教学！小伙伴们选择适合自己的就行。

一、火山图

火山图展示的是差异分子的显著性（P<0.05 或者 P<0.01，作图时进行 - log10 转化）和变化倍数（变化倍数 LOG2 处理）。

火山图的优点是直观待筛的展示分子的整体差异变化结果。但是不能展示每个样本的表达变化。

如果想展示感兴趣的差异表达显著的分子，火山图是一个很好的选择。

1. R 语言画法

测序报告中展示的火山图通常是基于 R 语言绘制的。

R 安装下载网址（长按复制至地址栏）：https://www.r-project.org/

首先，准备数据。在此以一份 miRNA 芯片数据为例。

数据链接（想练手的可下载）：https://pan.baidu.com/s/ 1jL4W9Tu8 hFaBH2I6FgF_kw

图片来源：数据截图

接着，教大家一种最简单的 R 代码，只需用 plot 函数就可实现。

R 代码如下：

图片来源：自己做的

（1）创建工作目录，读入数据，一般保存为 txt 文件读入；（代码 1、2）

（2）将「P.Value」进行「-log10」处理，设置为 Y 轴。一般测序文件对变化倍数进行了「log2」处理。「log2FC」设为 x 轴。（代码 3、4）

（3）画出散点图，添加 X，Y 轴名称，图形名称以及「点」的颜色。（代码 5、6）

图片来源：自己做的

（4）分别设置 P 值和变化倍数的阈值，阈值的设置按照个人要求。（代码 7、8）

（5）对于变化倍数大于 2 的上调基因标记为红色，下调基因标为蓝色。（代码 9、10）

图片来源：自己做的

（6）添加阈值线。（代码 11、12、13）

最终效果如下：

图片来源：自己做的

最后，点击「export」，选择图片格式导出图片即可。

图片来源：软件截图

2. GraphPad prism 绘制

如有小伙伴觉得 R 代码麻烦，则可选用常见软件「GraphPad prism」制图。

软件可在官网下载：https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/

首先， 在 excel 中进行 P 值的处理。

数据格式如下，选中需处理的数据，插入公式「=-LOG10 (P value)」

图片来源：自己做的

打开 GraphPad prism5 软件，选择「XY」-「散点图」。

图片来源：软件截图

粘贴数据至软件，如下：

图片来源：软件截图

图片来源：自己做的

接着，进行修饰

双击 Y 轴，点击「frame and origin」-「set origin」-「lower left」，将坐标轴放置左边。

图片来源：软件截图

添加阈值线

「x = 2」和「x =- 2」，表示变化倍数大于 4。同时设置「Y = 1.30103」，这个值对应「-log10 0.05.」表示 P 值小于 0.05。

在刚才出现的界面，点击「X axis」-「additional ticks and grid lines」。

再点击「Y axis」-「additional ticks and grid lines」，输入数字，勾选「line」。

图片来源：软件截图

图片来源：软件截图

点击红色区域，设置阈值线格式，包括颜色，粗细等。

图片来源：软件截图

如下：

图片来源：自己做的

右键单击任意的「点」，设置「点」的大小、颜色、尺寸等。这里把几个显著上调基因标为红色，下调的标为蓝色。

图片来源：软件截图

图片来源：软件截图

还可添加感兴趣的基因名称到火山图，这样就更加直观了。

右键单击某个点 -「format this point」-「show row names」。这样就显示名称了。双击文字，可以修改字体及大小。最后加上坐标轴名称，整个图就完成了。如下：

图片来源：软件截图

图片来源：自己做的

最后，按照所需格式保存即可。

二、热图

热图，主要展示某个基因在各个样本中的表达情况。

热图的优点是能够直观的看出基因在样品中的表达变化趋势，能很好的展示整体表达变化。热图也是测序数据必要的展示手段。

1. R 语言绘制

画热图需要的数据是基因的表达矩阵，这里自己整理了一个示例数据。行为「基因」，列为「样本」。

数据连接（感兴趣者可下载练习）：

https://pan.baidu.com/s/ 1IBJxheWqz8EvfBMdzrliaw

图片来源：自己做的

代码如下：

图片来源：自己做的

（1）创建工作目录；（代码 1）

（2）对样品进行分类；（代码 2）

（3）读入表达文件；（代码 3）

（4）明确分组信息，与表达矩阵结合，并查看；（代码 4、5）

（5）载入画图的软件包 heatmap；（代码 6）

（6）画图并制定图形信息。（代码 7）

重要代码信息解释如下：

图片来源：自己做的

最终效果图：

图片来源：自己做的

最后，保存图片即可。

2. GraphPad prism 绘制

火山图低版本的 GraphPad prism 就可实现，热图是最新版本增加的功能。最新版本还有很多新的功能哦！大家快学习起来吧。

打开软件，界面如下，点击「grouped」- 选择「enter or import data into a newtable」-「option」选择「enter and plot a single Y for each point」。

图片来源：软件截图

将数据粘贴至软件中：

图片来源：软件截图

进行相关系数分析

点击「analysis」-「multiple variable analyses」-「correlation matrix」-「OK」。

图片来源：软件截图

这里选择 person 相关系数，也可选择其他，按照自己需求，然后点击「OK」即可。

图片来源：软件截图

样品间的相关系数矩阵如下：

图片来源：软件截图

点击左侧「Graphs」下的「new graph」-「grouped」-「Heat map」。

图片来源：软件截图

图片来源：软件截图

点击「OK」，即刻生成初步的图形。

图片来源：自己做的

接着，进行图形调整

双击图形，在出现的界面中设置热图颜色和行列名等。

图片来源：软件截图

图片来源：软件截图

最后，保存并导出图片。

此类热图也有一个小缺点，不能进行聚类，笔者也期望后续的软件更新会解决这个问题。

以上就是用 R 语言和 GraphPad prism 软件绘制火山图和热图的方法。

当然，除了这两种绘制方法。目前还有一大批在线的工具可供我们使用，在此，笔者提供两个网址，有兴趣的小伙伴可去尝试绘制一下：

SOURCEFORGE

网址：https://sourceforge.net/projects/mev-tm4 /

OMICSHARE

网址：https://www.omicshare.com/tools/

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