基因克隆的流程

研究某个 gene 的功能通常要做相关的功能实验，常用的手段有 gain-of-function，涉及 gene 的过表达，在下文中即将讲述；还有 loss-of-function， 通常涉及 gene 的 knock-out 或 konck-down，暂且不提。

今天准备跟大家分享一下如何成功地用传统酶切酶连的方法克隆某 gene 的经验，虽然现在同源重组的方法已经越来越广泛地应用到科研中，属于 technology based innovation，给实验带来极大便利。

但是传统的克隆方法还是占主要地位，尤其是新兴的方法如果要做 gain-of-function 仍然逃避不了克隆 gene 片段这个步骤，打好相关的基础，掌握其中原理才能在各种 tools 出现时及时掌握并灵活应用。

1 首先获得某基因的序列

在 pubmed 主页下拉框选定 Gene 或者 Nucleotide，然后在输入框输入基因名称如 Znf516 点击 search 后，进入（如图 1）。

在左边分类 Sequence content 里选择 CCDS（如图 2），在右侧选择种属 Mus musculus（如图 3）， 这样就只会显示此基因的 CDS 结果。而页面加载出来后会有很多 Znf516 相关的信息包括基因名，全称，在 chromosome 上的位置及其相邻的基因有哪些，目前已知的此基因相关文献报道，可以忽略这些信息（当然也可以留意一下自己比较关注的那部分内容），在右侧栏目直接点击 CCDS，这样就进入了一个页面，在页面最下方是这个基因的 CDS 的核苷酸序列及蛋白翻译的序列。

可以将此序列 copy 到 snapgene 软件里即完成步骤一。

2 用 Snapgene 设计引物

注意：要看清楚载体上 promoter 的方向，将 CDS 正向插入到 promoter 后面的 MCS 中间。想要 snapgene 软件？请在对话框回复基因。

比如说 MCS 上的酶切位点是 ABCDE 五个酶切位点，那么设计引物是必须将 A 酶切位点加在 CDS 上游，B 加到 CDS 下游，不可颠倒。并且，最好保证选择的两个酶切位点在载体上不要相邻，如若必须如此则在切载体时先切割对保护保护碱基要求高的位点（请自行百度 NEB 酶切位点保护碱基，查保护碱基个数及切割效率），再切另一个位点。这样可以提高酶切效率。

这样就可以开始设计引物：用鼠标拖选 Znf516 前 28-25 bp（可以通过页面最下面一排的标题栏选择 Sequence，这样可以看到一个个的核苷酸序列，方便拖选，而且在拖选的时候会显示多少 bp 的序列被选中，GC 比以及 Tm 值，很方便）， 一般 Tm 值为 50-60C 都是可以接受的。点击 Add primer（如图 6）。

这样就跳出提示框，是需要选中序列的 Top strand（正向序列） 还是 bottom strand（反向互补序列），对于正向 / 上游引物，选择正向序列（若是反向 / 下游引物，选择反向互补序列）。

比如我要设计 Znf516 正向引物，并加 XbaI 的酶切位点，那么如图 7：选择 Insertions 中第二行 site 下拉框中的 XbaI，点击 Insert。即将酶切位点（红色大写字母的 6 位碱基）加到了引物上游（如图 8），一般在酶切位点旁边加保护碱基（NEB 主页有优化的保护碱基序列，初学者可以注意一下，克隆做熟练了发现其实不必如此苛刻。根据 GC 比，如果 GC 比正常 55%，或偏低，加两个 g, 如果高则加若干 t）。

引物的命名应该规范一些这样之后在实验室管理及整理时比较方便，一般如下：酶切位点 - 种属缩写 - 基因名 - F/R

反向引物设计如图 9。

这样引物这一步骤完成了，送到生工合成即可。我们 Lab 现在统一用 synbio，新兴「国产」公司，价格便宜且态度优良，更可贵的是支持晚上 11：00 下单，想必大多数生物汪都会因此喜欢上它。

3 寻找合适的模板

找到高表达这个 gene 的 tissue, 在 gene 表达丰度高时后期实验更易成功，这个可 refer 各种 paper, 或者 BioGPS website，非常 powerful。

使用方式大概是：打开网站，输入 GeneX，点选 species, 之后就出来各种细胞系或者组织表达此 geneX 相对量，找到表达 X 高的组织用其的 cDNA 当模板来做 PCR。

如果遇见要 P 组织特异性的 gene 的 variant，那么提高此组织 cDNA 的量或者两轮 PCR（第一轮 P 万后用作模板再 P 一次）都是可行的。

4 获得目标片段

例如从 forebrain cortex 组织的模板上 P 这个 gene, 我们使用的是 KOD 酶（Takara，日产，酶中「墨渊」）。改变很多 PCR 条件都无法 P 出这个 gene（之所以今天举这个栗子，原因就在于此），后分析发现这个 Znf516 平均 GC 含量 61%，局部的 GC 含量高导致 P 出片段不对。此时师兄光环笼罩，指点小僧道： 加 DMSO 有助于 P 高 GC 的基因，遂悟。我的经验做法是 100ul 体系加 0.8uL。

得到目标序列后，切胶回收（紫外照射对身体尤其眼睛不好，给 DNA 胶插上几个枪头确定坐标，在照胶时注意目的条带的位置，之后再关掉紫外去切胶避免手和胳膊及眼睛被紫外毒害，可谓是「穷苦」实验室首选妙法）。

5 酶切连接转化

酶切回收片段及载体后，将载体：DNA 片段 = 1：8 加到连接体系，16 度用 T4 酶连接 15 min，或更久，转化到感受态即可。

6 鉴定：挑克隆摇菌

如果赶时间的话可以边挑菌边鉴定。用 Taq Premix 做鉴定即可。鉴定完送测菌液。之后找公司索要正确序列对应的质粒，至此就得到了您想要的克隆。

最后可能会遇见的问题，在实验过程中如果遇见要构建的蛋白没有很好用的抗体，或者做体外 co-IP 等相关实验，需要构建一个融合蛋白，方便之后用 tag 检测：可以利用软件将 CDS 翻译为蛋白，必要时添加碱基，使目标 CDS 与 tag CDS in frame（中间间隔的 linker 是 3 的倍数，因为编码是以 3 个碱基一组的）；如果 tag 在下游，要去掉基因上的终止密码子。