“电子”基因克隆

利用计算机来协助克隆 基因，称为“电子”基因克隆 （sillcon cloning），是与定位克隆 、定位候选克隆 策略并列的方法之一，即采用生物信息学的方法延伸EST序列，以获得基因部分乃至全长的cDNA序列。EST数据库的迅速扩张，已经并将继续导致识别与克隆 新基因策略发生革命性变化。

1 EST序列的获取

利用计算机来协助克隆的第一步是必须获得感兴趣的EST，在dbEST数据库中找出EST的最有途径是寻找同源序列，标准：长度≥100bp，同源性50%以上、85%以下。可通过数个万维网界而使用BLAST检索程度实现，其中最常用的如NCBI（National center for Biotechnology Information）的eneBank、意大利Tigem的ESTmachine（包括EST提取者和EST组装机器）、THC（Tentative human Consensus Sequences）数据库、ESTBlast检索程序——通过英国人类基因组作图项目资源中心（Human genome Mapping Project Resource Center，HGMP—RC）服务器上访问。然后将检出序列组装为重叠群（contig），以此重叠群为被检序列，重复进行BLAST检索与序列组装，延伸重叠样系列，重复以上过程，直到没有更多的重叠EST检出或者说重叠群序列不能继续延伸，有时可获得全长的基因编码序列。获得这些EST序列数据后，再与GeneBank核酸数据库进行相似性检测，假如凤有精确匹配基因，将EST序列数据据EST六种阅读框翻译成蛋白质，接着与蛋白质序列数据库进行比较分析。基因分析的结果大致有三种：第一是已知基因，是研究对象为人类已鉴定和了解的基因；第二是以前未经鉴定的新基因；第三是未知基因，这部分基因之间无同种或异种基因的匹配。新基因和未知基因将进一步用于生物学研究。

2 基因的电子定位

基因的电子定位采用NCBI的电子PCR程序进行检索，寻找EST序列上是否存在序列标签位点（sequence tagged sites,STS），STS作为基因组中的单拷贝序列，是新一代的遗传标记系统，其数目多，覆盖密度较大，达到平均每1kb一个STS或更密集。将寻找到的STS与相应的染色体相比较，即可将此序列定位在该染色体上。

3 IMAGE克隆的索取

许多ESTs所对应的cDNA克隆 可通过基因组及其表达的整合分子分析（intergrated molecular analysis of genomes and their expression，IMAGE）协定免疫索取，这与电子基因克隆 相辅相成，IMAGE协定由美国LLNL国家实验室主持，宗旨是共享排列好的cDNA文库中的克隆 重，大规模的EST测序项目如Merk&Cow公司投资的人类ESTs项目等都加入了IMAGE协定。当研究者通过另外的途径得到基因的部分序列，并通过同源性检索后发现该片段与加入IMAGE协定的EST序列高度同源时，便可免费索取其原始克隆 ，可通过美国的ATCC组织（American type Culture Collection）索取，从而避免或减轻筛选全长基因的麻烦，以集中精力进行基因的功能研究。